JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

In vitro selectie van aptameren om infectieuze van niet-infectieuze virussen te onderscheiden

Published: September 07, 2022
doi:
10.3791/64127
, , ,
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry,University of Texas at Austin

Summary

We bieden een protocol dat algemeen kan worden toegepast op het selecteren van aptameren die alleen binden aan infectieuze virussen en niet aan virussen die niet-infectieus zijn gemaakt door een desinfectiemethode of aan andere soortgelijke virussen. Dit opent de mogelijkheid om de infectiviteitsstatus te bepalen in draagbare en snelle tests.

Abstract

Virusinfecties hebben een grote impact op de samenleving; De meeste detectiemethoden hebben moeite om te bepalen of een gedetecteerd virus besmettelijk is, wat vertragingen in de behandeling en verdere verspreiding van het virus veroorzaakt. Het ontwikkelen van nieuwe sensoren die kunnen informeren over de infecteerbaarheid van klinische of omgevingsmonsters zal deze onvervulde uitdaging aangaan. Er zijn echter maar weinig methoden die detectiemoleculen kunnen verkrijgen die een intact infectieus virus kunnen herkennen en het kunnen onderscheiden van hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door desinfectiemethoden. Hier beschrijven we een protocol om aptameren te selecteren die infectieuze virussen kunnen onderscheiden van niet-infectieuze virussen met behulp van systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX). We maken gebruik van twee functies van SELEX. Ten eerste kan SELEX op maat worden gemaakt om concurrerende doelwitten, zoals niet-infectieuze virussen of andere soortgelijke virussen, te verwijderen met behulp van tegenselectie. Bovendien kan het hele virus worden gebruikt als doelwit voor SELEX, in plaats van bijvoorbeeld een viraal oppervlakte-eiwit. Hele virus SELEX maakt de selectie van aptameren mogelijk die specifiek binden aan de inheemse toestand van het virus, zonder de noodzaak om het virus te verstoren. Met deze methode kunnen dus herkenningsmiddelen worden verkregen op basis van functionele verschillen in het oppervlak van pathogenen, die niet van tevoren bekend hoeven te zijn.

Introduction

Virusinfecties hebben enorme economische en maatschappelijke gevolgen over de hele wereld, zoals steeds duidelijker werd uit de recente COVID-19-pandemie. Tijdige en nauwkeurige diagnose is van het grootste belang bij de behandeling van virale infecties en voorkomt de verspreiding van virussen naar gezonde mensen. Hoewel er veel virusdetectiemethoden zijn ontwikkeld, zoals PCR-tests1,2 en inmunoassays3, zijn de meeste van de momenteel gebruikte methoden niet in staat om te bepalen of het gedetecteerde virus daadwerkelijk besmettelijk is of niet. Dit komt omdat de aanwezigheid van componenten van het virus alleen, zoals viraal nucleïnezuur of eiwitten, niet aangeeft dat het intacte, infectieuze virus aanwezig is, en niveaus van deze biomarkers hebben een slechte correlatie met infectiviteitaangetoond 4,5,6. Viraal RNA, dat vaak wordt gebruikt voor de huidige PCR-gebaseerde COVID-19-tests, heeft bijvoorbeeld zeer lage niveaus in de vroege stadia van infectie wanneer de patiënt besmettelijk is, terwijl het RNA-niveau vaak nog steeds erg hoog is wanneer patiënten zijn hersteld van de infectie en niet langer besmettelijk zijn 7,8. De virale eiwit- of antigeenbiomarkers volgen een vergelijkbare trend, maar verschijnen meestal zelfs later dan het virale RNA en zijn dus nog minder voorspellend voor de infecteerbaarheid 6,9. Om deze beperking aan te pakken, zijn enkele methoden ontwikkeld die kunnen informeren over de infectiviteitsstatus van het virus, maar zijn gebaseerd op celkweekmicrobiologische technieken die veel tijd (dagen of weken) nodig hebben om resultaten te verkrijgen 4,10. Zo kan het ontwikkelen van nieuwe sensoren die kunnen informeren over de infecteerbaarheid van klinische of omgevingsmonsters vertragingen in de behandeling en verdere verspreiding van het virus voorkomen. Er zijn echter maar weinig methoden die detectiemoleculen kunnen verkrijgen die een intact infectieus virion kunnen herkennen en onderscheiden van hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt.

In deze context zijn aptameren bijzonder geschikt als een uniek biomoleculair hulpmiddel11,12,13,14. Aptameren zijn korte, enkelstrengs DNA- of RNA-moleculen met een specifieke nucleotidesequentie waarmee ze een specifieke 3D-conformatie kunnen vormen om een doelwit met hoge affiniteit en selectiviteit te herkennen15,16. Ze worden verkregen door een combinatorisch selectieproces dat systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) wordt genoemd, ook bekend als in vitro selectie, dat wordt uitgevoerd in reageerbuizen met een grote willekeurige DNA-bemonsteringsbibliotheek van 10 14-1015 sequenties17,18,19. In elke ronde van dit iteratieve proces wordt de DNA-pool eerst onderworpen aan een selectiedruk door incubatie met het doelwit onder de gewenste omstandigheden. Alle sequenties die niet aan het doel zijn gebonden, worden vervolgens verwijderd, waardoor alleen die paar sequenties overblijven die onder de gegeven omstandigheden kunnen binden. Ten slotte worden de sequenties die in de vorige stap zijn geselecteerd, versterkt door PCR, waardoor de populatie van de pool wordt verrijkt met de gewenste functionele sequenties voor de volgende selectieronde en wordt het proces herhaald. Wanneer de activiteit van de selectiepool een plateau bereikt (meestal na 8-15 rondes), wordt de bibliotheek geanalyseerd door DNA-sequencing om de winnende sequenties te identificeren die de hoogste affiniteit vertonen.

SELEX heeft unieke voordelen die kunnen worden benut om verhoogde selectiviteit te verkrijgen ten opzichte van andere vergelijkbare doelen20,21, zoals voor de infectieiviteitsstatus van het virus22. Ten eerste kan een breed scala aan verschillende soorten doelen worden gebruikt voor de selectie, van kleine moleculen en eiwitten tot hele pathogenen en cellen16. Om dus een aptamer te verkrijgen die zich bindt aan een infectieus virus, kan een intact virus als doelwit worden gebruikt, in plaats van een viraal oppervlakte-eiwit19. Hele virus SELEX maakt de selectie van aptameren mogelijk die specifiek binden aan de oorspronkelijke toestand van het virus, zonder de noodzaak van verstoring van het virus. Ten tweede kan SELEX op maat worden gemaakt om concurrerende doelen 21,23, zoals andere soortgelijke virussen of niet-infectieuze geïnactiveerde virussen, te verwijderen met behulp van tegenselectiestappen in elke selectieronde22. Tijdens de tegenselectiestappen wordt de DNA-pool blootgesteld aan doelen waarvoor binding niet gewenst is en worden eventuele sequenties die binden weggegooid.

In dit werk bieden we een protocol dat algemeen kan worden toegepast voor het selecteren van aptameren die binden aan een infectieus virus, maar niet aan hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door een bepaalde desinfectiemethode of aan een ander verwant virus. Deze methode maakt het mogelijk om herkenningsmiddelen te verkrijgen op basis van functionele verschillen van het virusoppervlak, die niet van tevoren bekend hoeven te zijn, en biedt dus een extra voordeel voor de detectie van nieuw opgedoken pathogenen of voor onderbelichte ziekten.

Protocol

1. Bereiding van reagentia en buffers Bereid 10x Tris-boraat EDTA (10x TBE) door 0,9 M Tris-base, 0,9 M boorzuur, 20 mM EDTA (dinatriumzout) en gedeïoniseerd water toe te voegen tot een eindvolume van 1 L. Meng tot alle componenten zijn opgelost. Bereid als volgt een 10% denaturerende polyacrylamide-stockoplossing. Voeg in een glazen fles van 250 ml 120 g ureum (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) oplossing en voldoende gedestilleerd water toe om het uite…

Representative Results

Aangezien DNA-aptameren kunnen worden verkregen met behulp van SELEX in een reageerbuis15, is deze SELEX-strategie zorgvuldig ontworpen om zowel positieve selectiestappen naar het intacte, hele infectieuze virus te omvatten (d.w.z. de DNA-moleculen te behouden die aan het infectieuze virus binden), als tegenselectiestappen voor hetzelfde virus dat niet-infectieus is gemaakt door een bepaalde desinfectiemethode, specifiek UV-behandeling, door het weggooien van de DNA-sequenties die kunnen binden a…

Discussion

SELEX maakt niet alleen de identificatie mogelijk van aptameren met een hoge affiniteit, in het pM-nM-bereik 22,43,44,45, maar ook met een hoge en instelbare selectiviteit. Door gebruik te maken van tegenselectie kunnen aptameren met uitdagende selectiviteit worden verkregen. De Li-groep heeft bijvoorbeeld het vermogen aangetoond om sequenties te verkrijgen die pathogene bacteriestammen kunnen…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen mevrouw Laura M. Cooper en Dr. Lijun Rong van de Universiteit van Illinois in Chicago bedanken voor het verstrekken van de pseudovirusmonsters die in dit protocol worden gebruikt (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), evenals Dr. Alvaro Hernandez en Dr. Chris Wright van de DNA Services-faciliteit van het Roy J. Carver Biotechnology Center aan de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign voor hun hulp bij high-throughput sequencing, en veel leden van de Lu-groep die ons hebben geholpen met in vitro selectie en aptamer karakteriseringstechnieken. Dit werk werd ondersteund door een RAPID-subsidie van de National Science Foundation (CBET 20-29215) en een zaadsubsidie van het Institute for Sustainability, Energy and Environment aan de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign en Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. bedankt de PEW Latin American Fellowship voor de financiële steun. We bedanken ook de Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) voor de ondersteuning van het Lu-groepsonderzoeksprogramma aan de Universiteit van Texas in Austin.

Materials

10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA – Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -. F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. . Babraham bioinformatics – FastQC a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022)
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  35. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  36. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  37. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  38. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  39. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  40. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  41. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  42. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  43. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  44. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  45. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  46. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  47. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  48. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  49. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  50. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  51. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Tags

Aptamer SelectionIn Vitro SelectionInfectious VirusNon-infectious VirusSELEXAffinity-based SelectionVirus DetectionVirus InfectivityDiagnostic SensingEnvironmental Monitoring
check_url/it/64127?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image