In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren

Summary

Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, das im Allgemeinen auf die Auswahl von Aptameren angewendet werden kann, die nur an infektiöse Viren binden und nicht an Viren, die durch eine Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurden, oder an andere ähnliche Viren. Dies eröffnet die Möglichkeit, den Infektiositätsstatus in tragbaren und Schnelltests zu bestimmen.

Abstract

Virusinfektionen haben große Auswirkungen auf die Gesellschaft; Die meisten Nachweismethoden haben Schwierigkeiten bei der Feststellung, ob ein nachgewiesenes Virus infektiös ist, was zu Verzögerungen bei der Behandlung und einer weiteren Ausbreitung des Virus führt. Die Entwicklung neuer Sensoren, die Aufschluss über die Infektierbarkeit von klinischen oder Umweltproben geben können, wird diese ungelöste Herausforderung meistern. Es gibt jedoch nur sehr wenige Methoden, die Sensormoleküle erhalten, die ein intaktes infektiöses Virus erkennen und es von demselben Virus unterscheiden können, das durch Desinfektionsmethoden nicht infektiös gemacht wurde. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Auswahl von Aptameren, das infektiöse Viren von nicht-infektiösen Viren unterscheiden kann, indem wir systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) verwenden. Wir machen uns zwei Funktionen von SELEX zunutze. Erstens kann SELEX maßgeschneidert werden, um konkurrierende Ziele, wie z. B. nicht-infektiöse Viren oder andere ähnliche Viren, durch Counter-Selektion zu entfernen. Darüber hinaus kann das gesamte Virus als Ziel für SELEX verwendet werden, anstatt beispielsweise ein virales Oberflächenprotein. SELEX ermöglicht die Auswahl von Aptameren, die spezifisch an den nativen Zustand des Virus binden, ohne dass das Virus gestört werden muss. Diese Methode ermöglicht es somit, Erkennungsmittel auf der Grundlage funktioneller Unterschiede in der Oberfläche von Krankheitserregern zu erhalten, die nicht im Voraus bekannt sein müssen.

Introduction

Virusinfektionen haben weltweit enorme wirtschaftliche und gesellschaftliche Auswirkungen, wie die jüngste COVID-19-Pandemie immer deutlicher wurde. Eine rechtzeitige und genaue Diagnose ist von größter Bedeutung, um Virusinfektionen zu behandeln und gleichzeitig die Ausbreitung von Viren auf gesunde Menschen zu verhindern. Obwohl viele Virusnachweismethoden entwickelt wurden, wie z. B. PCR-Tests^1,2 und Inmunoassays³, sind die meisten der derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, festzustellen^, ob das nachgewiesene Virus tatsächlich infektiös ist oder nicht. Dies liegt daran, dass das Vorhandensein von Bestandteilen des Virus allein, wie z. B. virale Nukleinsäure oder Proteine, nicht darauf hinweist, dass das intakte, infektiöse Virus vorhanden ist, und die Konzentrationen dieser Biomarker eine schlechte Korrelation mit der Infektiosität gezeigt haben ^4,5,6. So weist beispielsweise die virale RNA, die üblicherweise für die aktuellen PCR-basierten COVID-19-Tests verwendet wird, in den frühen Stadien der Infektion sehr niedrige Werte auf, wenn der Patient ansteckend ist, während der RNA-Spiegel oft noch sehr hoch ist, wenn sich die Patienten von der Infektion erholt haben und nicht mehr ansteckend sind ^7,8. Die viralen Protein- oder Antigen-Biomarker folgen einem ähnlichen Trend, treten aber in der Regel noch später als die virale RNA auf und sind daher noch weniger prädiktiv für die Infektiosität ^6,9. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, wurden einige Methoden entwickelt, die Aufschluss über den Infektiositätsstatus des Virus geben können, aber auf mikrobiologischen Techniken der Zellkultur basieren, die eine lange Zeit (Tage oder Wochen) benötigen, um Ergebnisse zu erhalten ^4,10. So kann die Entwicklung neuer Sensoren, die Aufschluss über die Infektierbarkeit von klinischen oder Umweltproben geben können, Verzögerungen bei der Behandlung und eine weitere Ausbreitung des Virus vermeiden. Es gibt jedoch nur sehr wenige Methoden, die Sensormoleküle erhalten, die ein intaktes infektiöses Virion erkennen und es von demselben Virus unterscheiden können, das nicht infektiös geworden ist.

In diesem Zusammenhang eignen sich Aptamere besonders gut als einzigartiges biomolekulares Werkzeug ^11,12,13,14. Aptamere sind kurze, einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, die es ihnen ermöglicht, eine spezifische 3D-Konformation zu bilden, um ein Ziel mit hoher Affinität und Selektivität zu erkennen^15,16. Sie werden durch einen kombinatorischen Selektionsprozess erhalten, der als systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) bezeichnet wird, auch bekannt als In-vitro-Selektion, der in Reagenzgläsern mit einer großen zufälligen DNA-Probenbibliothek von 10 14-10 15 Sequenzen durchgeführt wird^17,18,19. In jeder Runde dieses iterativen Prozesses wird der DNA-Pool zunächst durch Inkubation mit dem Target unter den gewünschten Bedingungen einem Selektionsdruck ausgesetzt. Alle Sequenzen, die nicht an das Ziel gebunden sind, werden dann entfernt, so dass nur die wenigen Sequenzen übrig bleiben, die unter den gegebenen Bedingungen binden können. Schließlich werden die im vorherigen Schritt ausgewählten Sequenzen durch PCR amplifiziert, wodurch die Population des Pools mit den gewünschten funktionellen Sequenzen für die nächste Selektionsrunde angereichert wird, und der Vorgang wird wiederholt. Wenn die Aktivität des Selektionspools ein Plateau erreicht (in der Regel nach 8-15 Runden), wird die Bibliothek durch DNA-Sequenzierung analysiert, um die Gewinnsequenzen mit der höchsten Affinität zu identifizieren.

SELEX hat einzigartige Vorteile, die genutzt werden können, um eine erhöhte Selektivität gegen andere ähnliche Zielmoleküle 20,21 zu erreichen^, z. B. für den Infektiositätsstatus des Virus²². Erstens kann eine Vielzahl unterschiedlicher Arten von Targets für die Selektion verwendet werden, von kleinen Molekülen und Proteinen bis hin zu ganzen Krankheitserregern und Zellen¹⁶. Um ein Aptamer zu erhalten, das an ein infektiöses Virus bindet, kann daher ein intaktes Virus anstelle eines viralen Oberflächenproteins als Ziel verwendet werden¹⁹. SELEX ermöglicht die Auswahl von Aptameren, die spezifisch an den nativen Zustand des Virus binden, ohne dass das Virus gestört werden muss. Zweitens kann SELEX so maßgeschneidert werden, dass konkurrierende Zielmoleküle ^21,23, wie z. B. andere ähnliche Viren oder nicht-infektiöse inaktivierte Viren, unter Verwendung von Gegenauswahlschritten in jeder Auswahlrunde²² entfernt werden. Während der Zählerauswahlschritte wird der DNA-Pool Zielen ausgesetzt, für die eine Bindung nicht erwünscht ist, und alle Sequenzen, die binden, werden verworfen.

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das allgemein für die Auswahl von Aptameren verwendet werden kann, die an ein infektiöses Virus binden, aber nicht an dasselbe Virus, das durch eine bestimmte Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurde, oder an andere verwandte Viren. Diese Methode ermöglicht es, Erkennungsmittel auf der Grundlage funktioneller Unterschiede der Virusoberfläche zu erhalten, die nicht im Voraus bekannt sein müssen, und bietet so einen zusätzlichen Vorteil für den Nachweis neu aufgetretener Erreger oder für wenig erforschte Krankheiten.

Protocol

1. Herstellung von Reagenzien und Puffern Bereiten Sie 10x Trisborat-EDTA (10x TBE) zu, indem Sie 0,9 M Tris-Base, 0,9 M Borsäure, 20 mM EDTA (Dinatriumsalz) und deionisiertes Wasser zu einem Endvolumen von 1 l hinzufügen. Mischen, bis sich alle Komponenten aufgelöst haben. Bereiten Sie eine 10%ige denaturierende Polyacrylamid-Stammlösung wie folgt vor. In eine 250-ml-Glasflasche werden 120 g Harnstoff (8 m), 25 ml 10-facher FSME, 62,5 ml 40%ige Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (29:…

Representative Results

Da DNA-Aptamere unter Verwendung von SELEX in einem Reagenzglas15 gewonnen werden können, wurde diese SELEX-Strategie sorgfältig entwickelt, um sowohl positive Selektionsschritte in Richtung des intakten, vollständigen infektiösen Virus (d. h. die Beibehaltung der DNA-Moleküle, die an das infektiöse Virus binden) als auch Gegenauswahlschritte für dasselbe Virus zu umfassen, das durch eine bestimmte Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurde. insbesondere UV-Behandlung, indem die D…

Discussion

SELEX ermöglicht nicht nur die Identifizierung von Aptameren mit hoher Affinität, im pM-nM-Bereich 22,43,44,45^, sondern auch mit hoher und abstimmbarer Selektivität. Durch die Ausnutzung der Counter-Selektion können Aptamere mit anspruchsvoller Selektivität erhalten werden. So hat die Li-Gruppe beispielsweise gezeigt, dass sie in der Lage ist, Sequenzen zu erhalten, mit denen pathogene Ba…

Materials

10% Ammonium persulfate (APS)	BioRad	1610700
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
1x PBS without calcium & magnesium	Corning	21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution	BioRad	1610146
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC501024	cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC510024	cut-off 100 kDa
Boric Acid	Sigma-Aldrich	100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module	BioRad	1851148
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters	Thermo Scientific	88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Thermo Fisher	65001	streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661	1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit	Takara Bio USA, Inc.	632200	Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube	Thermo Scientific	MR02
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	BioRad	MSB1001	non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels	BioRad	1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates	BioRad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers	BioRad	1653310
Molecular Biology Grade Water	Lonza	51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear	BioRad	MLP9611
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase	New England BioLab	M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI	Tecan	0344NB-A01	High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)	Gilson	F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets	Labconco	4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)	Thomas Scientific	1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002440
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	1725201	qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8	USA scientific	AB1183	PCR tubes
Urea	Sigma-Aldrich	U5128