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Bioingegneria

감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별하기 위한 압타머의 시험관 내 선택

Published: September 07, 2022
doi:
10.3791/64127
, , ,
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry,University of Texas at Austin

Summary

우리는 일반적으로 감염성 바이러스에만 결합하는 앱타머를 선택하고 소독 방법에 의해 비감염성이 된 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이것은 휴대용 및 신속한 테스트에서 감염성 상태를 결정할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

Abstract

바이러스 감염은 사회에 큰 영향을 미칩니다. 대부분의 검출 방법은 검출 된 바이러스가 전염성이 있는지 여부를 판단하는 데 어려움이있어 치료가 지연되고 바이러스가 더 확산됩니다. 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알려줄 수 있는 새로운 센서를 개발하면 이러한 미충족 과제를 해결할 수 있습니다. 그러나 온전한 감염성 바이러스를 인식하고 소독 방법으로 비감염성이 된 동일한 바이러스와 구별할 수 있는 감지 분자를 얻을 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화를 사용하여 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별할 수 있는 앱타머를 선택하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 SELEX의 두 가지 기능을 활용합니다. 첫째, SELEX는 카운터 선택을 사용하여 비감염성 바이러스 또는 기타 유사한 바이러스와 같은 경쟁 표적을 제거하도록 맞춤 제작할 수 있습니다. 추가로, 전체 바이러스는 예를 들어 바이러스 표면 단백질 대신에 SELEX에 대한 표적으로서 사용될 수 있다. 전체 바이러스 SELEX는 바이러스를 파괴할 필요 없이 바이러스의 본래 상태에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택할 수 있습니다. 따라서이 방법은 사전에 알 필요가없는 병원체 표면의 기능적 차이에 기초하여 인식 제제를 얻을 수있게한다.

Introduction

바이러스 감염은 최근 COVID-19 대유행으로 인해 점점 더 분명해진 바와 같이 전 세계적으로 막대한 경제적, 사회적 영향을 미칩니다. 시기 적절하고 정확한 진단은 건강한 사람들에게 바이러스가 퍼지는 것을 방지하면서 바이러스 감염을 치료하는 데 가장 중요합니다. PCR 검사1,2 및 면역검사3와 같은 많은 바이러스 검출 방법이 개발되었지만, 현재 사용되는 대부분의 방법은 검출된 바이러스가 실제로 감염되는지 여부를 판단할 수 없습니다. 이는 바이러스 핵산이나 단백질과 같은 바이러스 단독의 성분의 존재가 손상되지 않은 감염성 바이러스가 존재한다는 것을 나타내지 않고 이러한 바이오마커의 수준이 감염성과 빈약한 상관관계를 나타내기 때문입니다 4,5,6. 예를 들어, 현재 PCR 기반 COVID-19 검사에 일반적으로 사용되는 바이러스 RNA는 환자가 전염성이 있을 때 감염 초기 단계에서 매우 낮은 수준을 갖는 반면, 환자가 감염에서 회복되어 더 이상 전염성이 없을 때 RNA 수준은 여전히 매우 높은 경우가 많습니다 7,8. 바이러스 단백질 또는 항원 바이오마커는 유사한 경향을 따르지만 일반적으로 바이러스 RNA보다 훨씬 늦게 나타나므로 감염 가능성을 예측할 수 훨씬 적습니다 6,9. 이러한 한계를 해결하기 위해, 바이러스의 감염성 상태를 알려줄 수 있는 몇 가지 방법이 개발되었지만, 결과를 얻기 위해 오랜 시간(일 또는 몇 주)을 필요로 하는 세포 배양 미생물학 기술을 기반으로 한다 4,10. 따라서 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알릴 수 있는 새로운 센서를 개발하면 치료 지연 및 바이러스의 추가 확산을 방지할 수 있습니다. 그러나 손상되지 않은 감염성 비리온을 인식하고 비감염성이 된 동일한 바이러스와 구별할 수 있는 감지 분자를 얻을 수 있는 방법은 거의 없습니다.

이러한 맥락에서, 앱타머는 독특한 생체 분자 도구로서 특히 매우 적합하다(11,12,13,14). 앱타머는 특정 뉴클레오티드 서열을 가진 짧은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자로, 높은 친화력과 선택성을 가진 표적을 인식하기 위해 특정 3D 형태를 형성할 수 있습니다15,16. 이들은 10 14-10 15 서열17,18,19의 큰 무작위 DNA 샘플링 라이브러리를 가진 시험관에서 수행되는 시험관 내 선택으로도 알려진 지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화 (SELEX)라고하는 조합 선택 과정에 의해 얻어진다. 이 반복 과정의 각 라운드에서 DNA 풀은 먼저 원하는 조건에서 표적과의 배양을 통해 선택 압력을 받습니다. 그런 다음 대상에 바인딩되지 않은 모든 시퀀스가 제거되고 주어진 조건에서 바인딩할 수 있는 몇 개의 시퀀스만 남게 됩니다. 마지막으로, 이전 단계에서 선택된 서열은 PCR에 의해 증폭되어 다음 선택 라운드를 위해 원하는 기능 서열로 풀의 모집단을 풍부하게 하고 프로세스가 반복됩니다. 선택 풀의 활성이 고원에 도달하면(일반적으로 8-15라운드 후) 라이브러리를 DNA 시퀀싱으로 분석하여 가장 높은 친화도를 나타내는 우승 서열을 식별합니다.

SELEX는 바이러스(22)의 감염성 상태와 같은 다른 유사한 표적(20,21)에 대해 증가된 선택성을 얻기 위해 이용될 수 있는 독특한 이점을 갖는다. 첫째, 소분자 및 단백질로부터 전체 병원체 및 세포에 이르기까지 매우 다양한 유형의 표적이 선택에 사용될 수 있다16. 따라서, 감염성 바이러스에 결합하는 앱타머를 얻기 위해, 바이러스 표면 단백질19 대신에 온전한 바이러스를 표적으로 사용할 수 있다. 전체 바이러스 SELEX를 사용하면 바이러스를 파괴할 필요 없이 바이러스의 본래 상태에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택할 수 있습니다. 둘째로, SELEX는 선택(22)의 각 라운드에서 카운터 선택 단계들을 사용하여, 다른 유사한 바이러스 또는 비감염성 불활성화 바이러스와 같은 경쟁 타겟(21, 23)을 제거하도록 맞춤형으로 제작될 수 있다. 카운터 선택 단계 동안, DNA 풀은 결합이 바람직하지 않은 표적에 노출되고, 결합하는 임의의 서열은 폐기된다.

이 작업에서 우리는 감염성 바이러스에 결합하지만 특정 소독 방법에 의해 비감염성이 된 동일한 바이러스 또는 다른 관련 바이러스에는 결합하지 않는 앱타머를 선택하는 데 일반적으로 적용할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 사전에 알 필요가 없는 바이러스 표면의 기능적 차이를 기반으로 인식 제제를 얻을 수 있으므로 새로 출현한 병원체의 검출 또는 연구가 부족한 질병에 대한 추가적인 이점을 제공합니다.

Protocol

1. 시약 및 완충액의 제조 0.9 M 트리스-염기, 0.9 M 붕산, 20 mM EDTA (디소듐 염) 및 탈이온수를 1 L의 최종 부피에 첨가하여 10x 트리스-보레이트 EDTA(10x TBE)를 준비한다. 다음과 같이 10% 변성 폴리아크릴아미드 원액을 준비한다. 250mL 유리병에 요소(8M) 120g, 10x TBE 25mL, 40% 아크릴아마이드/비스아크릴아미드(29:1) 용액 62.5mL, 최종 부피 250mL에 도달할 때까지 충분한 증류수를 넣습니?…

Representative Results

DNA 앱타머는 시험관(15)에서 SELEX를 사용하여 얻을 수 있기 때문에, 이 SELEX 전략은 온전한 전체 감염성 바이러스에 대한 양성 선택 단계(즉, 감염성 바이러스에 결합하는 DNA 분자를 보유함)뿐만 아니라 특정 소독 방법에 의해 비감염성이 된 동일한 바이러스에 대한 반대 선택 단계를 모두 포함하도록 신중하게 설계되었습니다. 특히 자외선 처리는 비감염성 바이러스에 결합할 수 …

Discussion

SELEX는 pM-nM 범위 22,43,44,45에서 높은 친화력을 가진 압타머를 식별할 수 있을 뿐만 아니라 높고 조정 가능한 선택성도 제공합니다. 카운터 선택을 활용하면 선택성이 어려운 압타머를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, Li 그룹은 병원성 박테리아 균주와 비병원성 균주를 구별할 수 있는 서열을 얻을 수 있?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로토콜에 사용된 유사바이러스 샘플(SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1)을 제공한 시카고 일리노이 대학의 Ms. Laura M. Cooper와 Dr. Lijun Rong, 그리고 고처리량 시퀀싱에 도움을 주신 일리노이 대학교 어바나-샴페인에 있는 Roy J. Carver Biotechnology Center의 DNA 서비스 시설의 Dr. Alvaro Hernandez와 Dr. Chris Wright에게 감사드립니다. 그리고 시험관 내 선택 및 압타머 특성화 기술로 우리를 도운 Lu 그룹의 많은 구성원. 이 연구는 국립 과학 재단 (CBET 20-29215)의 RAPID 보조금과 일리노이 대학교 어 바나 샴페인 및 일리노이 – JITRI 연구소 (JITRI 23965)의 지속 가능성, 에너지 및 환경 연구소의 종자 보조금으로 지원되었습니다. ASP는 재정 지원에 대해 PEW Latin American Fellowship에 감사드립니다. 또한 오스틴에 있는 텍사스 대학교의 Lu 그룹 연구 프로그램을 지원해 주신 Robert A. Welch Foundation(보조금 F-0020)에도 감사드립니다.

Materials

10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128
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Riferimenti

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Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).
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