Caractérisation de l’interactome du lysosome neuronal avec protéomique de marquage de proximité
Summary
Un protocole protéomique de marquage de proximité des lysosomes neuronaux est décrit ici pour caractériser le microenvironnement lysosomal dynamique dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Les protéines de la membrane lysosomale et les protéines qui interagissent avec les lysosomes (de manière stable ou transitoire) peuvent être quantifiées avec précision dans cette méthode avec une excellente résolution spatiale intracellulaire dans les neurones humains vivants.
Abstract
Les lysosomes communiquent fréquemment avec une variété de biomolécules pour obtenir la dégradation et d’autres fonctions cellulaires diverses. Les lysosomes sont essentiels au fonctionnement du cerveau humain, car les neurones sont postmitotiques et dépendent fortement de la voie autophagie-lysosome pour maintenir l’homéostasie cellulaire. Malgré les progrès réalisés dans la compréhension de diverses fonctions lysosomales, la capture des communications hautement dynamiques entre les lysosomes et d’autres composants cellulaires est techniquement difficile, en particulier à haut débit. Ici, un protocole détaillé est fourni pour la méthode protéomique de marquage de proximité des lysosomes endogènes (knock-in) récemment publiée dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC).
Les protéines de la membrane lysosomale et les protéines entourant les lysosomes dans un rayon de 10 à 20 nm peuvent être identifiées avec confiance et quantifiées avec précision dans les neurones humains vivants. Chaque étape du protocole est décrite en détail, c’est-à-dire la culture de neurones hiPSC, le marquage de proximité, la récolte de neurones, la microscopie à fluorescence, l’enrichissement en protéines biotinylées, la digestion des protéines, l’analyse LC-MS et l’analyse des données. En résumé, cette méthode protéomique de marquage de proximité lysosomale endogène unique fournit un outil analytique robuste et à haut débit pour étudier les activités lysosomales hautement dynamiques dans les neurones humains vivants.
Introduction
Les lysosomes sont des organites cataboliques qui dégradent les macromolécules par la voie lysosomale-autophagie1. Outre la dégradation, les lysosomes sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires telles que la transduction de signalisation, la détection des nutriments et la sécrétion 2,3,4. Les perturbations de la fonction lysosomale ont été impliquées dans les troubles du stockage lysosomal, le cancer, le vieillissement et la neurodégénérescence 3,5,6,7. Pour les neurones postmitotiques et hautement polarisés, les lysosomes jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie cellulaire neuronale, la libération de neurotransmetteurs et le transport à longue distance le long des axones 8,9,10,11. Cependant, l’étude des lysosomes dans les neurones humains a été une tâche difficile. Les progrès récents dans les technologies neuronales dérivées de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la culture de neurones humains vivants qui étaient auparavant inaccessibles, comblant le fossé entre les modèles animaux et les patients humains pour étudier le cerveau humain12,13. En particulier, la technologie avancéei3Neuron intègre de manière stable le facteur de transcription neurogénine-2 dans le génome iPSC sous un promoteur inductible par la doxycycline, conduisant les iPSCs à se différencier en neurones corticaux purs en 2 semaines14,15.
En raison de l’activité lysosomale hautement dynamique, la capture des interactions lysosomales avec d’autres composants cellulaires est techniquement difficile, en particulier à haut débit. La technologie de marquage de proximité est bien adaptée à l’étude de ces interactions dynamiques en raison de sa capacité à capturer à la fois les interactions protéiques stables et transitoires/faibles avec une spécificité spatiale exceptionnelle16,17. La peroxydase ou la biotine ligase modifiée peut être génétiquement fusionnée à la protéine appât. Lors de l’activation, des radicaux biotine hautement réactifs sont produits pour marquer de manière covalente les protéines voisines, qui peuvent ensuite être enrichies par des billes enrobées de streptavidine pour la protéomique ascendante en aval via des plateformes de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) 17,18,19,20,21.
Une méthode protéomique de marquage de proximité lysosomale endogène a récemment été développée pour capturer le microenvironnement lysosomal dynamique dans i3neurones22. L’ascorbate peroxydase modifiée (APEX2) a été frappée sur l’extrémité C de la protéine membranaire lysosomale associée 1 (LAMP1) dans les CSPi, qui peut ensuite être différenciée en neurones corticaux. LAMP1 est une protéine membranaire lysosomale abondante et un marqueur lysosomalclassique 23. LAMP1 est également exprimé dans les endosomes tardifs, qui mûrissent en lysosomes; Ces endosomes-lysosomes tardifs et lysosomes non dégradants sont tous appelés lysosomes dans le présent protocole. Cette sonde endogène LAMP1-APEX, exprimée au niveau physiologique, peut réduire la mauvaise localisation et les artefacts de surexpression de LAMP1. Des centaines de protéines membranaires lysosomales et d’interacteurs lysosomaux peuvent être identifiés et quantifiés avec une excellente résolution spatiale dans des neurones humains vivants.
Ici, un protocole détaillé pour la protéomique de marquage de proximité des lysosomes dans les neurones humains dérivés de l’iPSC est décrit avec d’autres améliorations par rapport à la méthode22 récemment publiée. Le flux de travail global est illustré à la figure 1. Le protocole comprend la culture de neurones dérivée de hiPSC, l’activation du marquage de proximité dans les neurones, la validation de l’activité APEX par microscopie à fluorescence, la détermination d’un rapport optimal entre les billes de streptavidine et les protéines d’entrée, l’enrichissement des protéines biotinylées, la digestion des protéines sur les billes, le dessalage et la quantification des peptides, l’analyse LC-MS et l’analyse des données protéomiques. Les directives de dépannage et les optimisations expérimentales sont également abordées pour améliorer le contrôle qualité et les performances de l’étiquetage de proximité.
Protocol
Representative Results
Discussion
À l’aide de cette sonde LAMP1-APEX, les protéines sur et près de la membrane lysosomale sont biotinylées et enrichies. Compte tenu du diamètre typique du lysosome de 100 à 1 200 nm, cette méthode offre une excellente résolution intracellulaire avec un rayon de marquage de 10 à 20 nm. LAMP1 est une protéine membranaire lysosomale abondante et un marqueur classique pour les lysosomes, servant d’excellente protéine appât pour le marquage APEX lysosomal au niveau de l’expression endogène. Cependant, il exi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude est soutenue par la subvention des NIH (R01NS121608). A.M.F. reconnaît la bourse ARCS-Metro Washington Chapter et la bourse de dotation Bourbon F. Scribner. Nous remercions le laboratoire Michael Ward du National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) pour son soutien en biologie moléculaire et le développement de la technologie i3Neuron.
Materials
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
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