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Neuroscienze

近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64132
, ,
1Department of Chemistry,The George Washington University

Summary

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおける動的リソソーム微小環境を特徴付けるために、ニューロンリソソーム近接標識プロテオミクスプロトコルについて説明します。リソソーム膜タンパク質およびリソソームと相互作用するタンパク質(安定または一過性)は、生きたヒトニューロンにおいて優れた細胞内空間分解能でこの方法では正確に定量することができる。

Abstract

リソソームは、さまざまな生体分子と頻繁に通信して、分解やその他の多様な細胞機能を実現します。ニューロンは有糸分裂後であり、細胞の恒常性を維持するためにオートファジー-リソソーム経路に大きく依存しているため、リソソームは人間の脳機能にとって重要です。さまざまなリソソーム機能の理解が進んでいるにもかかわらず、リソソームと他の細胞成分との間の非常に動的なコミュニケーションをキャプチャすることは、特にハイスループットの方法で技術的に困難です。ここでは、最近発表されたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)由来ニューロンにおける内因性(ノックイン)リソソーム近接標識プロテオミクス法の詳細なプロトコルを提供します。

ライソソーム膜タンパク質と半径10〜20 nm以内のリソソーム周囲のタンパク質の両方を、生きたヒトニューロンで確実に同定し、正確に定量することができます。プロトコルの各ステップ、すなわち、hiPSCニューロン培養、近接標識、ニューロン収穫、蛍光顕微鏡、ビオチン化タンパク質濃縮、タンパク質消化、LC-MS分析、およびデータ分析が詳細に説明されています。要約すると、このユニークな内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、生きたヒトニューロンにおける非常に動的なリソソーム活性を研究するためのハイスループットで堅牢な分析ツールを提供します。

Introduction

リソソームは、リソソーム-オートファジー経路1を介して高分子を分解する異化細胞小器官です。分解に加えて、リソソームはシグナル伝達、栄養感知、分泌などの多様な細胞機能に関与しています2,3,4。リソソーム機能の摂動は、リソソーム蓄積障害、癌、老化、および神経変性に関与しています3,5,6,7。有糸分裂後および高度に分極したニューロンの場合、リソソームは、ニューロン細胞の恒常性、神経伝達物質の放出、および軸索に沿った長距離輸送において重要な役割を果たします8、9、10、11。しかし、ヒトのニューロンのリソソームを調べることは困難な作業でした。人工多能性幹細胞(iPSC)由来のニューロン技術の最近の進歩により、以前はアクセスできなかった生きたヒトニューロンの培養が可能になり、動物モデルとヒト患者の間のギャップを埋めてヒト脳を研究するようになりました12,13。特に、高度なi3Neuron技術は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの下で神経ゲニン-2転写因子をiPS細胞ゲノムに安定的に組み込み、iPS細胞を2週間で純粋な皮質ニューロンに分化させる14,15。

非常に動的なリソソーム活性のため、他の細胞成分とのリソソーム相互作用を捕捉することは、特にハイスループット方式で技術的に困難です。近接標識技術は、並外れた空間特異性で安定したタンパク質相互作用と一過性/弱いタンパク質相互作用の両方を捕捉できるため、これらの動的相互作用の研究に適しています16,17。操作されたペルオキシダーゼまたはビオチンリガーゼは、ベイトタンパク質に遺伝的に融合することができる。活性化されると、反応性の高いビオチンラジカルが生成され、隣接するタンパク質に共有結合で標識され、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)プラットフォームを介して下流のボトムアッププロテオミクス用のストレプトアビジンコーティングビーズによって濃縮されます17、18、19、20、21。

内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、i3Neurons22の動的リソソーム微小環境を捕捉するために最近開発されました。操作されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX2)は、iPS細胞のリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)のC末端にノックインされ、皮質ニューロンに分化することができます。LAMP1は、豊富なリソソーム膜タンパク質であり、古典的なリソソームマーカー23である。LAMP1は後期エンドソームでも発現し、リソソームに成熟します。これらの後期エンドソームリソソームおよび非分解性リソソームは、すべてこのプロトコルではリソソームと呼ばれる。この内因性LAMP1-APEXプローブは、生理学的レベルで発現し、LAMP1の誤局在および過剰発現アーティファクトを低減することができる。数百のリソソーム膜タンパク質とリソソーム相互作用物質を、生きたヒトニューロンにおいて優れた空間分解能で同定および定量することができます。

ここでは、ヒトiPS細胞由来ニューロンにおけるリソソーム近接標識プロテオミクスのための詳細なプロトコルを、最近公開された方法22からのさらなる改良を加えて説明する。全体的なワークフローを 図 1 に示します。このプロトコルには、hiPSc由来のニューロン培養、ニューロンにおける近接標識活性化、蛍光顕微鏡によるAPEX活性の検証、最適なストレプトアビジンビーズとインプットタンパク質の比率の決定、ビオチン化タンパク質の濃縮、ビーズ上のタンパク質消化、ペプチドの脱塩と定量、LC-MS分析、およびプロテオミクスデータ分析が含まれます。トラブルシューティングのガイドラインと実験的な最適化についても説明し、近接ラベリングの品質管理とパフォーマンスを向上させます。

Protocol

すべての手順は、ジョージワシントン大学のバイオセーフティおよび倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用される媒体およびバッファーの組成を 表1に示します。ここで使用している商用製品情報は、 材料表に記載されています。 1. ヒトiPS細胞由来ニューロン培養 ヒトiPS細胞培養とLAMP1-APEXプローブ統?…

Representative Results

このリソソーム近接標識プロテオミクス研究は、ヒトiPS細胞由来のニューロンで実施され、生きたニューロンの動的なリソソーム微小環境 をin situ でキャプチャしました。異なる時点におけるhiPS細胞およびhiPSC由来ニューロンの細胞形態を 図2Aに示す。ヒトiPS細胞はE8培地中のコロニーで増殖する。分化は、iPS細胞をドキシサイクリン含有ニューロン誘導培地に?…

Discussion

このLAMP1-APEXプローブを使用して、リソソーム膜上および近傍のタンパク質をビオチン化し、濃縮します。典型的なリソソーム直径が100〜1,200 nmの場合、この方法は10〜20 nmの標識半径で優れた細胞内分解能を提供します。LAMP1は豊富なリソソーム膜タンパク質であり、ライソソームの古典的マーカーであり、内因性発現レベルでのリソソームAPEX標識のための優れたベイトタンパク質として機能…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIH助成金(R01NS121608)によってサポートされています。AMFは、ARCS-メトロワシントン支部奨学金とバーボンF.スクリブナー基金フェローシップを認めています。国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)のマイケル・ウォード研究室の分子生物学支援とi3ニューロン技術開発に感謝します。

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture
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Riferimenti

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Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).
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