JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Характеристика нейронального лизосомного интерактома с протеомикой бесконтактной маркировки

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64132
, ,
1Department of Chemistry,The George Washington University

Summary

Протокол протеомики по маркировке близости нейронных лизосом описан здесь для характеристики динамического лизосомального микроокружения в индуцированных человеком плюрипотентных нейронах, полученных из стволовых клеток. Лизосомальные мембранные белки и белки, которые взаимодействуют с лизосомами (стабильно или временно), могут быть точно количественно определены в этом методе с отличным внутриклеточным пространственным разрешением в живых нейронах человека.

Abstract

Лизосомы часто общаются с различными биомолекулами для достижения деградации и других разнообразных клеточных функций. Лизосомы имеют решающее значение для функции человеческого мозга, поскольку нейроны являются постмитотическими и в значительной степени зависят от аутофагии-лизосомного пути для поддержания клеточного гомеостаза. Несмотря на достижения в понимании различных лизосомальных функций, захват высокодинамических связей между лизосомами и другими клеточными компонентами является технически сложным, особенно с высокой пропускной способностью. Здесь представлен подробный протокол для недавно опубликованного эндогенного (knock-in) лизосомного бесконтактного мечения протеомным методом в нейронах, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC).

Как лизосомальные мембранные белки, так и белки, окружающие лизосомы в радиусе 10-20 нм, могут быть уверенно идентифицированы и точно количественно определены в живых нейронах человека. Каждый шаг протокола подробно описан, т.е. культура hiPSC-нейронов, бесконтактная маркировка, сбор нейронов, флуоресцентная микроскопия, обогащение биотинилированного белка, переваривание белка, анализ LC-MS и анализ данных. Таким образом, этот уникальный эндогенный лизосомальный метод бесконтактной маркировки протеомики обеспечивает высокопроизводительный и надежный аналитический инструмент для изучения высокодинамной лизосомальной активности в живых нейронах человека.

Introduction

Лизосомы представляют собой катаболические органеллы, которые разлагают макромолекулы через лизосомально-аутофагический путь1. Помимо деградации, лизосомы участвуют в различных клеточных функциях, таких как сигнальная трансдукция, восприятие питательных веществ и секреция 2,3,4. Возмущения в лизосомальной функции были вовлечены в лизосомальные нарушения хранения, рак, старение и нейродегенерацию 3,5,6,7. Для постмитотических и высокополяризованных нейронов лизосомы играют решающую роль в нейрональном клеточном гомеостазе, высвобождении нейротрансмиттеров и переносе на большие расстояния вдоль аксонов 8,9,10,11. Тем не менее, исследование лизосом в нейронах человека было сложной задачей. Недавние достижения в области технологий нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), позволили культуре живых человеческих нейронов, которые ранее были недоступны, преодолев разрыв между животными моделями и пациентами-людьми для изучения человеческого мозга12,13. В частности, передовая технология i3Neuron стабильно интегрирует фактор транскрипции нейрогенина-2 в геном iPSC под действием промотора, индуцируемого доксициклином, заставляя iPSCs дифференцироваться в чистые корковые нейроны за 2 недели14,15.

Из-за высокодинамической лизосомальной активности захват лизосомальных взаимодействий с другими клеточными компонентами является технически сложным, особенно в высокопроизводительном режиме. Технология бесконтактной маркировки хорошо подходит для изучения этих динамических взаимодействий из-за ее способности захватывать как стабильные, так и переходные/слабые белковые взаимодействия с исключительной пространственной специфичностью16,17. Инженерная пероксидаза или биотинлигаза может быть генетически слита с белком приманки. После активации высокореакционноспособные радикалы биотина продуцируются для ковалентной маркировки соседних белков, которые затем могут быть обогащены шариками, покрытыми стрептавидином, для последующей протеомики снизу вверх с помощью платформ жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) 17,18,19,20,21.

Недавно был разработан эндогенный лизосомальный метод бесконтактной маркировки протеомики для захвата динамического лизосомального микроокружения в i3нейронах22. Сконструированная аскорбатпероксидаза (APEX2) была введена на С-конец лизосомально-ассоциированного мембранного белка 1 (LAMP1) в иПСК, который затем может быть дифференцирован в корковые нейроны. LAMP1 является обильным лизосомальным мембранным белком и классическим лизосомальным маркером23. LAMP1 также экспрессируется в поздних эндосомах, которые созревают в лизосомы; эти поздние эндосомы-лизосомы и недеградирующие лизосомы упоминаются в этом протоколе как лизосомы. Этот эндогенный зонд LAMP1-APEX, выраженный на физиологическом уровне, может уменьшить артефакты неправильной локализации и сверхэкспрессии LAMP1. Сотни лизосомальных мембранных белков и лизосомальных интеракторов могут быть идентифицированы и количественно определены с отличным пространственным разрешением в живых нейронах человека.

Здесь описан подробный протокол для лизосомной бесконтактной маркировки протеомики в нейронах человека, полученных из iPSC, с дальнейшими улучшениями по сравнению с недавно опубликованным методом22. Общий рабочий процесс показан на рисунке 1. Протокол включает в себя культуру нейронов, полученную из hiPSC, активацию бесконтактной маркировки в нейронах, проверку активности APEX с помощью флуоресцентной микроскопии, определение оптимального соотношения бусин стрептавидина к входному белку, обогащение биотинилированных белков, переваривание белка на шариках, обессоливание и количественное определение пептидов, анализ LC-MS и анализ данных протеомики. Также обсуждаются рекомендации по устранению неполадок и экспериментальные оптимизации для улучшения контроля качества и производительности бесконтактной маркировки.

Protocol

Все процедуры были одобрены комитетом по биобезопасности и этике Университета Джорджа Вашингтона. Составы сред и буферов, используемых в этом протоколе, приведены в таблице 1. Информация о коммерческом продукте, используемая здесь, приведена в Таблице материалов. <p…

Representative Results

Это исследование протеомики, маркирующей близость лизосом, было проведено в нейронах человека, полученных из iPSC, для захвата динамического лизосомального микроокружения in situ в живых нейронах. Клеточные морфологии hiPSCs и нейронов, полученных hiPSC, в разные моменты времени проиллюстр…

Discussion

Используя этот зонд LAMP1-APEX, белки на лизосомальной мембране и рядом с ней биотинилируются и обогащаются. Учитывая типичный диаметр лизосомы 100-1 200 нм, этот метод обеспечивает отличное внутриклеточное разрешение с радиусом маркировки 10-20 нм. LAMP1 является обильным лизосомальным мембранны?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование поддерживается грантом NIH (R01NS121608). A.M.F. признает стипендию ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship и стипендию Фонда Бурбона Ф. Скрибнера. Мы благодарим лабораторию Майкла Уорда в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта (NINDS) за поддержку молекулярной биологии и разработку технологии i3Neuron.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Tags

Proximity Labeling ProteomicsLysosomal MicroenvironmentIPSC-derived NeuronsLysosomal DysfunctionBrain DiseasesBiotin PhenolHydrogen PeroxideAcetone PrecipitationProtein PelletDCA Assay
check_url/it/64132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image