רכיבים חיוניים של Borreliella (Borrelia) burgdorferi בדיקות תמלול חוץ גופי
Summary
מבחני שעתוק חוץ גופיים יכולים לפענח את מנגנוני ויסות השעתוק בבורליאלה בורגדורפרי. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לטיהור B. burgdorferi RNA פולימראז וביצוע תגובות שעתוק חוץ גופי. גישות ניסיוניות המשתמשות במבחני שעתוק חוץ גופי דורשות טיהור ואחסון אמינים של RNA פולימראז פעיל.
Abstract
Borreliella burgdorferi הוא פתוגן חיידקי עם רפרטואר מטבולי וגנומי מוגבל. B. burgdorferi עובר באופן חוץ-תאי בין חולייתנים וקרציות ומשנה באופן דרמטי את פרופיל השעתוק שלו כדי לשרוד בסביבות שונות במהלך זיהום. מוקד המחקר של B. burgdorferi הוא להבין בבירור כיצד החיידק מגיב לסביבתו באמצעות שינויי שעתוק. מבחני שעתוק חוץ גופיים מאפשרים לנתח ביוכימית את המנגנונים הבסיסיים של ויסות השעתוק. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר טיהור ואחסון של B. burgdorferi RNA פולימראז, טיהור גורם סיגמא, יצירת תבניות DNA ומבחני שעתוק חוץ גופי . הפרוטוקול מתאר את השימוש ב-RNA פולימראז מטוהר מ-B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC הוא זן שפורסם בעבר בעל תג 10XHis על הגן rpoC המקודד את תת-היחידה הגדולה ביותר של RNA פולימראז. בדיקות שעתוק חוץ גופיות מורכבות מ-RNA פולימראז מטוהר מזן 5A4-RpoC, גרסה רקומביננטית של גורם הסיגמא RpoD, ותבנית DNA דו-גדילי הנוצרת על ידי PCR. בעוד שטכניקות טיהור החלבונים והגישות להרכבה במבחני שעתוק חוץ גופי מובנות היטב ונפוצות יחסית, שיקולי הטיפול בפולימראז RNA שונים לעתים קרובות מאורגניזם לאורגניזם. הפרוטוקול המוצג כאן מיועד למחקרים אנזימטיים על B. burgdorferi RNA polymerase. ניתן להתאים את השיטה לבדיקת תפקידם של גורמי שעתוק, מקדמים ושינויים לאחר תרגום על פעילות ה-RNA פולימראז.
Introduction
מחלת ליים וקדחת התקפית נגרמות על ידי פתוגנים spirochete בסוגים Borrelia ו Borreliella 1,2,3. מחלת ליים היא מחלה בולטת המועברת על ידי וקטורים בצפון אמריקה, וכתוצאה מכך, Borreliella burgdorferi הוא אורגניזם מודל בולט לחקר ביולוגיה ספירוצ’טה 4,5. מחקרים על מנגנוני ויסות השעתוק של B. burgdorferi נועדו להבין טוב יותר את הסתגלותו לשינויים בסביבה כאשר הוא עובר בין וקטור הקרציות שלו לבין פונדקאים של יונקים 6,7. שינויים ב- pH, טמפרטורה, אוסמולריות, זמינות חומרי מזון, חומצות שומן קצרות שרשרת, חומצות אורגניות ורמות חמצן מומס ופחמן דו חמצני מווסתים את ביטוי הגנים החשובים ל- B. burgdorferi לשרוד בווקטור פרוקי הרגליים שלו ולהדביק בעלי חיים 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. קישור תגובות אלה לגירויים עם מנגנוני ויסות היה היבט חשוב במחקר B. burgdorferi 19.
גורמי שעתוק וגורמי סיגמא שולטים בשעתוק גנים המבצעים תהליכים תאיים. לליים ולספירוצ’טות קדחת התקפיתיות יש קבוצה דלילה יחסית של גורמי שעתוק וגורמי סיגמה חלופיים. למרות זאת, ישנם שינויי שעתוק מורכבים המכוונים את תגובות B. burgdorferi לסביבה20,21,22. המנגנונים הספציפיים המניעים שינויי שעתוק ב- B. burgdorferi בתגובה לשינויים סביבתיים עדיין אינם ברורים. מבחני שעתוק חוץ גופי הם כלים רבי עוצמה לשימוש בגישה ביוכימית להערכת הפונקציה ומנגנוני הבקרה של גורמי שעתוק וגורמי סיגמא23,24,25,26.
לאחרונה הוקמה מערכת בדיקת שעתוק חוץ גופית באמצעות B. burgdorferi RNA polymerase24. מכיוון שלחיידקים יש לעתים קרובות פיזיולוגיות תאיות ייחודיות, RNA פולימראז ממינים וסוגים שונים מגיב באופן שונה לטיהור אנזימים, אחסון אנזימים ותנאי חיץ תגובה27. B. burgdorferi גם מרוחק גנטית ממיני חיידקים רבים שבהם נחקרו RNA פולימראזות20. היבטים של הכנת אנזימים כגון ליזה, שטיפה ותנאי חיץ אלוציה, מאגר אחסון, מאגר תגובת שעתוק חוץ גופית ושיטת בניית הבדיקה יכולים כולם לשנות את פעילות ה- RNA פולימראז. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול לטיהור RNA פולימראז וגורם סיגמא RpoD, ייצור תבנית DNA ליניארית דו-גדילית, ובניית מבחני שעתוק חוץ גופיים כדי להקל על יכולת השחזור בין מעבדות המשתמשות במערכת זו. אנו מפרטים תגובה לדוגמה כדי להדגים את הטווח הליניארי עבור תמלול תלוי RpoD ולדון במגבלות ובחלופות לגישה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבחני שעתוק חוץ גופיים שנבנו באמצעות הפרוטוקול המוצג שימשו לאחרונה לחקר תפקידו של גורם שעתוק ב- B. burgdorferi וניתן ליישם אותם לבניית ניסויים דומים באמצעות גורמי שעתוק אחרים, גורמי סיגמא ומולקולות23. לאחר קבלת RNA פולימראז פעיל מ– B. burgdorferi וזיהוי פעילותו, ניתן לשנות רכי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן ההשקעות האסטרטגיות למדעי הבריאות, מענק פיתוח סגל של אוניברסיטת קרייטון. זן B. burgdorferi RpoC-His10X סופק באדיבות על ידי ד”ר ד. סקוט סמואלס מאוניברסיטת מונטנה. זן E. coli המכיל את פלסמיד pMAL-C5X המקודד אלל rpoD המתויג כחלבון קושר מלטוז סופק באדיבות על ידי ד”ר פרנק גרארדיני ממעבדות הרי הרוקי, NIAID, NIH.
Materials
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
Riferimenti
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
