Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집
Summary
본 프로토콜은 Cryo-EM 실험에서 기울어진 단일 입자 데이터 수집을 위한 일반화되고 구현하기 쉬운 체계를 설명합니다. 이러한 절차는 공기-물 계면의 부착으로 인해 우선적인 방향 편향을 겪는 샘플에 대한 고품질 EM 맵을 얻는 데 특히 유용합니다.
Abstract
초저온 전자 현미경(Cryo-EM)에 의한 단일 입자 분석(SPA)은 이제 고분해능 구조 생물학의 주류 기술입니다. SPA에 의한 구조 결정은 얇은 얼음 층 내에서 유리화된 거대 분자 물체에 대한 여러 가지 뚜렷한 견해를 얻는 데 의존합니다. 이상적으로, 균일하게 분포 된 무작위 투영 방향의 집합은 물체의 모든 가능한 뷰에 해당하며, 등방성 방향 분해능을 특징으로하는 재구성을 발생시킵니다. 그러나 실제로 많은 샘플은 공기-물 계면에 부착된 우선적인 방향의 입자로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 이로 인해 데이터 세트에서 균일하지 않은 각도 방향 분포가 발생하고 재구성에서 불균일한 푸리에 공간 샘플링이 발생하여 이방성 분해능을 특징으로 하는 맵으로 변환됩니다. 시편 스테이지를 기울이는 것은 배향 분포의 균일성을 개선하여 분해능 이방성을 극복하고 푸리에 공간 샘플링의 등방성을 극복할 수 있는 일반화 가능한 솔루션을 제공합니다. 현재 프로토콜은 자동화된 이미지 획득을 위한 소프트웨어인 Leginon을 사용하는 기울어진 단계의 자동화된 데이터 수집 전략을 설명합니다. 이 절차는 구현이 간단하고 추가 장비나 소프트웨어가 필요하지 않으며 생물학적 거대분자 이미징에 사용되는 대부분의 표준 투과 전자 현미경(TEM)과 호환됩니다.
Introduction
지난 10년 동안 직접 전자 검출기 1,2,3의 출현 으로 단일 입자 Cryo-EM 4,5,6을 사용하여 해결된 거대분자 및 거대분자 어셈블리의 고분해능 구조 수가 기하급수적으로 증가했습니다. 크기가 ~10kDa 이하이거나7 미만인 가장 작은 단백질을 제외하고 거의 모든 정제된 거대분자 종은 Cryo-EM을 사용하여 구조를 측정할 수 있을 것으로 예상됩니다. 그리드 준비 및 구조 결정에 필요한 출발 물질의 양은 핵 자기 공명 분광법 및 X선 결정학 4,5,6과 같은 다른 구조 결정 기술보다 적어도 한 단계 적습니다.
그러나 Cryo-EM에 의한 구조 결정의 주요 과제는 이미징을 위한 적절한 그리드 준비와 관련이 있습니다. 다양한 유리화 전략과 그리드를 사용하여 다양한 시료를 평가한 광범위한 연구에 따르면, Cryo-EM 그리드에서 시료를 유리화하는 대부분의 접근법은 거대분자가 공기-물 계면에 우선적으로 부착되는 것으로 나타났다8. 이러한 순응은 잠재적으로 4가지 차선의 결과를 초래할 수 있다: (1) 거대분자 샘플은 완전히 변성되며, 이 경우 성공적인 데이터 수집 및 처리가 불가능하다; (2) 샘플이 부분적으로 변성되며, 이 경우 손상되지 않은 거대분자 영역으로부터 구조적 통찰력을 얻을 수 있습니다. (3) 샘플은 기본 구조를 유지하지만 전자빔의 방향에 대한 입자 방향의 한 세트만 이미지에 표시됩니다. (4) 샘플은 본래의 구조를 유지하고, 전자빔의 방향에 대한 가능한 입자 방향이 전부는 아니지만 일부가 이미지에 표현된다. 사례 (3)과 (4)의 경우, 기울어진 데이터 수집은 재구성된 Cryo-EM 맵에 영향을 미치는 방향 분해능 이방성을 최소화하는 데 도움이 되며 다양한 샘플에 대한 일반화 가능한 솔루션을 제공합니다9. 기술적으로, 틸팅은 또한 사례 (2)에 도움이 될 수 있는데, 이는 변성이 아마도 공기-물 계면에서 발생하고 유사하게 데이터 내에서 표현되는 뚜렷한 방향의 수를 제한하기 때문입니다. 데이터 세트의 방향 편향 범위는 솔루션 첨가제를 실험하여 잠재적으로 변경할 수 있지만 광범위한 적용 가능성이 부족하면 이러한 시행착오 접근 방식이 방해를 받습니다. 시편 스테이지를 최적화된 단일 기울기 각도로 기울이는 것은 이미징 실험9 의 기하학적 구조를 변경하여 방향 분포를 개선하기에 충분합니다(그림 1). 전자빔에 대한 우선적으로 배향된 샘플의 기하학적 구성으로 인해, 우선적인 배향의 각 클러스터에 대해, 그리드를 기울이는 것은 클러스터 중심에 대해 조명 각도의 원뿔을 생성한다. 따라서 이것은 뷰를 분산시키고 결과적으로 푸리에 공간 샘플링과 방향 분해능의 등방성을 향상시킵니다.
실제로 무대를 기울이는 데는 몇 가지 단점이 있습니다. 시편 스테이지를 기울이면 시야 전체에 초점 그라데이션이 발생하여 CTF(대비 전달 함수) 추정의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 기울어진 데이터 수집은 또한 기울어진 표본을 이미징할 때 증가된 충전 효과로 인해 빔으로 인한 입자 이동을 증가시킬 수 있습니다. 그리드 기울기는 또한 겉보기 얼음 두께의 증가로 이어지며, 이는 차례로 더 시끄러운 현미경 사진으로 이어지고 궁극적으로 재구성 5,9,10의 해상도에 영향을 미칠 수 있습니다. 프로토콜 및 토론 섹션에서 간략하게 설명된 고급 계산 데이터 처리 방식을 적용하여 이러한 문제를 극복하는 것이 가능할 수 있습니다. 마지막으로, 틸팅은 입자 겹침을 증가시켜 후속 이미지 처리 파이프라인을 방해할 수 있습니다. 이는 그리드 상의 입자 농도를 최적화하여 어느 정도 완화할 수 있지만 그럼에도 불구하고 중요한 고려 사항입니다. 여기에서는 Leginon 소프트웨어 제품군(자동 이미지 획득 소프트웨어)을 사용하여 기울어진 데이터 수집을 위해 구현하기 쉬운 프로토콜에 대해 설명하며, 오픈 액세스가 가능하고 광범위한 현미경11,12,13,14와 호환됩니다. 이 방법에는 버전 3.0 이상이 필요하며, 버전 3.3 이상에는 기울어진 데이터 수집을 가능하게 하는 전용 개선 사항이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에는 추가 소프트웨어나 장비가 필요하지 않습니다. 전산 인프라스트럭처 및 설치 가이드에 대한 광범위한 지침은 다른 곳에서 제공된다15.
Protocol
Representative Results
Discussion
공기-물 계면에 대한 시편 부착으로 인한 바람직한 입자 배향은 Cryo-EM SPA 4,5,6을 사용한 일상적인 고분해능 구조 측정의 마지막 주요 병목 현상 중 하나입니다. 여기에 제시된 데이터 수집 체계는 데이터 세트 내에서 입자의 방향 분포를 개선하기 위한 구현하기 쉬운 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 추가 장비나 소프트웨어?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
현미경 검사, Leginon 설치 및 데이터 전송 인프라에 대한 도움을 주신 Bill Anderson, Charles Bowman 및 Jean-Christophe Ducom(TSRI)에게 감사드립니다. 또한 원고를 비판적으로 읽어 주신 Gordon Louie (Salk Institute)와 Yong Zi Tan (싱가포르 국립 대학교)에게도 감사드립니다. DPS 발현을 위한 플라스미드를 제공해 주신 Chris Russo(MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge)에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립 보건원 (U54AI150472, U54 AI170855 및 R01AI136680 DL), 국립 과학 재단 (NSF MCB-2048095 DL), 허스트 재단 (DL), Arthur and Julie Woodrow Chair (JPN).
Materials
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
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