Kryo-EM-datainnsamling med enkeltpartikler med scenetilt ved bruk av Leginon

Summary

Denne protokollen beskriver et generalisert og lett implementert skjema for skråstilt enkeltpartikkeldatainnsamling i kryo-EM-eksperimenter. En slik prosedyre er spesielt nyttig for å skaffe et EM-kart av høy kvalitet for prøver som lider av fortrinnsorienteringsskjevhet på grunn av overholdelse av luft-vanngrensesnittet.

Abstract

Enkeltpartikkelanalyse (SPA) ved kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) er nå en vanlig teknikk for høyoppløselig strukturbiologi. Strukturbestemmelse ved SPA er avhengig av å oppnå flere forskjellige visninger av et makromolekylært objekt vitrifisert i et tynt lag av is. Ideelt sett ville en samling av jevnt fordelte tilfeldige projeksjonsorienteringer utgjøre alle mulige visninger av objektet, noe som gir opphav til rekonstruksjoner preget av isotrop retningsoppløsning. Men i virkeligheten lider mange prøver av fortrinnsvis orienterte partikler som fester seg til luft-vann-grensesnittet. Dette fører til ujevne vinkelorienteringsfordelinger i datasettet og inhomogen Fourier-rom-prøvetaking i rekonstruksjonen, oversatt til kart preget av anisotrop oppløsning. Vipping av prøvetrinnet gir en generaliserbar løsning for å overvinne oppløsningsanisotropi i kraft av å forbedre ensartetheten av orienteringsfordelinger, og dermed isotropien til Fourier-romprøvetaking. Den nåværende protokollen beskriver en automatisert datainnsamlingsstrategi på skråstilt stadium ved hjelp av Leginon, en programvare for automatisert bildeinnsamling. Prosedyren er enkel å implementere, krever ikke noe ekstra utstyr eller programvare, og er kompatibel med de fleste standard transmisjonselektronmikroskoper (TEM) som brukes til avbildning av biologiske makromolekyler.

Introduction

Fremkomsten av direkte elektrondetektorer i løpet av det siste tiåret ^1,2,3 har ansporet en eksponentiell økning i antall høyoppløselige strukturer av makromolekyler og makromolekylære sammenstillinger løst ved bruk av enkeltpartikkelkryo-EM 4,5,6. Nesten alle rensede makromolekylære arter forventes å være egnet til strukturbestemmelse ved bruk av kryo-EM, bortsett fra de minste proteinene ~ 10 kDa i størrelse eller under⁷. Mengden utgangsmateriale som trengs for gridforberedelse og strukturbestemmelse er minst en størrelsesorden mindre enn andre strukturbestemmelsesteknikker, for eksempel kjernemagnetisk resonansspektroskopi og røntgenkrystallografi ^4,5,6.

En hovedutfordring for strukturbestemmelse ved kryo-EM innebærer imidlertid egnet klargjøring av rutenett for avbildning. En omfattende studie som evaluerte ulike prøver ved hjelp av forskjellige vitrifikasjonsstrategier og rutenett antydet at de fleste tilnærminger for vitrifisering av prøver på kryo-EM-rutenett fører til fortrinnsvis overholdelse av makromolekyler til luft-vanngrensesnittet⁸. Slik etterlevelse kan potensielt forårsake fire suboptimale utfall: (1) den makromolekylære prøven denaturerer fullstendig, i hvilket tilfelle ingen vellykket datainnsamling og behandling er mulig; (2) prøven denaturerer delvis, i så fall kan det være mulig å oppnå strukturell innsikt fra regioner av makromolekylet som ikke er skadet; (3) prøven beholder innfødt struktur, men bare ett sett med partikkelorienteringer i forhold til retningen av elektronstrålen er representert i bildene; (4) prøven beholder naturlig struktur, og noen, men ikke alle mulige partikkelorienteringer i forhold til retningen til elektronstrålen er representert i bildene. For tilfeller (3) og (4) vil skråstilt datainnsamling bidra til å minimere retningsoppløsningsanisotropi som påvirker det rekonstruerte kryo-EM-kartet og gir en generaliserbar løsning for et bredt utvalg av prøver⁹. Teknisk sett kan vipping også være fordelaktig (2), siden denatureringen antagelig skjer ved luft-vann-grensesnittet og på samme måte begrenser antallet distinkte retninger som er representert i dataene. Graden av orienteringsskjevhet i datasettet kan potensielt endres ved å eksperimentere med løsningstilsetninger, men mangel på bred anvendelighet hindrer disse prøve-og-feile-tilnærmingene. Å vippe prøvetrinnet i en enkelt optimalisert hellingsvinkel er tilstrekkelig til å forbedre fordelingen av orienteringer i kraft av å endre geometrien til avbildningseksperimentet⁹ (figur 1). På grunn av den geometriske konfigurasjonen av den fortrinnsvis orienterte prøven med hensyn til elektronstrålen, for hver klynge av fortrinnsorienteringer, vipper rutenettet en kegle av belysningsvinkler i forhold til klyngesentroid. Derfor sprer dette utsikten og forbedrer følgelig Fourier-romprøvetaking og isotropien av retningsoppløsning.

Det er i praksis noen ulemper med å vippe scenen. Ved å vippe prøvetrinnet introduseres en fokusgradient over synsfeltet, noe som kan påvirke nøyaktigheten av CTF-estimeringer (contrast transfer function). Skråstilt datainnsamling kan også føre til økt stråleindusert partikkelbevegelse forårsaket av økte ladningseffekter ved avbildning av skråstilte prøver. Grid tilting fører også til en økning i tilsynelatende istykkelse, noe som igjen fører til støyende mikrografer og kan til slutt påvirke oppløsningen av rekonstruksjoner ^5,9,10. Det kan være mulig å løse disse problemene ved å bruke avanserte databehandlingsskjemaer som er kort beskrevet i protokoll- og diskusjonsseksjonene. Til slutt kan vipping føre til økt partikkeloverlapping, noe som hindrer den påfølgende bildebehandlingsrørledningen. Selv om dette til en viss grad kan reduseres ved å optimalisere partikkelkonsentrasjonen på nettet, er det likevel en viktig faktor. Her beskrives en protokoll som er enkel å implementere for skråstilt datainnsamling ved hjelp av Leginon-programvarepakken (en automatisert programvare for bildeinnsamling), tilgjengelig åpen tilgang og kompatibel med et bredt spekter av mikroskoper^11,12,13,14. Metoden krever minst versjon 3.0 eller nyere, med versjon 3.3 og utover som inneholder dedikerte forbedringer for å muliggjøre skråstilt datainnsamling. Ingen ekstra programvare eller utstyr er nødvendig for denne protokollen. Omfattende instruksjoner om beregningsinfrastruktur og installasjonsveiledninger er gitt andre steder¹⁵.

Protocol

1. Forberedelse av prøver Bruk rutenett som inneholder gullfolie og gullgitterstøtte16 (se Materialfortegnelse) fordi skråstilt datainnsamling kan fremheve stråleindusert bevegelse17.MERK: For denne studien ble prøver på rutenett vitrifisert ved hjelp av manuell stupende og blotting teknikk18 i et fuktet (større enn 80%) kjølerom (~ 4 ° C). Unngå å bruke rister som inneholder kobber…

Representative Results

DPS ved 0,3 mg/ml ble brukt til å demonstrere avbildning ved 0°, 30° og 60° helling. Data fra forskjellige hellingsvinkler ble samlet inn på samme rutenett i forskjellige rutenettregioner. CTF-oppløsning som passer for høyere vinkelhellinger har en tendens til å være dårligere, slik tilfellet var når man sammenlignet de tre datasettene i denne studien. Figur 4 viser komparative representative bilder og 2D-klassifiseringsgjennomsnitt. Selv om proteinkonsentrasjonen er uendret over …

Discussion

Foretrukket partikkelorientering forårsaket av prøvens overholdelse av luft-vann-grensesnittet er en av de siste store flaskehalsene for rutinemessig strukturbestemmelse med høy oppløsning ved bruk av kryo-EM SPA ^4,5,6. Datainnsamlingsskjemaet som presenteres her gir en enkel å implementere strategi for å forbedre orienteringsfordelingen av partikler i et datasett. Vi gjør oppmerksom på at protokollen ikke krever ekstra …

Materials

Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01