Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon

Summary

O presente protocolo descreve um esquema generalizado e de fácil implementação para coleta de dados de partícula única inclinada em experimentos de crio-EM. Tal procedimento é especialmente útil para a obtenção de um mapa EM de alta qualidade para amostras que sofrem de viés de orientação preferencial devido à aderência à interface ar-água.

Abstract

A análise de partículas únicas (SPA) por microscopia crio-eletrônica (cryo-EM) é agora uma técnica convencional para biologia estrutural de alta resolução. A determinação da estrutura por SPA baseia-se na obtenção de múltiplas visões distintas de um objeto macromolecular vitrificado dentro de uma fina camada de gelo. Idealmente, uma coleção de orientações de projeção aleatória uniformemente distribuídas equivaleria a todas as visões possíveis do objeto, dando origem a reconstruções caracterizadas por resolução direcional isotrópica. No entanto, na realidade, muitas amostras sofrem de partículas preferencialmente orientadas aderindo à interface ar-água. Isso leva a distribuições de orientação angular não uniformes no conjunto de dados e amostragem não homogênea no espaço de Fourier na reconstrução, traduzindo-se em mapas caracterizados por resolução anisotrópica. A inclinação do estágio do espécime fornece uma solução generalizável para superar a anisotropia de resolução em virtude de melhorar a uniformidade das distribuições de orientação e, portanto, a isotropia da amostragem espacial de Fourier. O presente protocolo descreve uma estratégia de coleta de dados automatizada em estágio inclinado utilizando o software Leginon, para aquisição automatizada de imagens. O procedimento é simples de implementar, não requer nenhum equipamento ou software adicional e é compatível com a maioria dos microscópios eletrônicos de transmissão (METs) padrão usados para obtenção de imagens de macromoléculas biológicas.

Introduction

O advento dos detectores diretos de elétrons na última década ^1,2,3 estimulou um aumento exponencial no número de estruturas de alta resolução de macromoléculas e montagens macromoleculares resolvidas usando crio-EM de partícula única 4,5,6. Espera-se que quase todas as espécies macromoleculares purificadas sejam passíveis de determinação de estrutura usando crio-EM, exceto para as menores proteínas ~10 kDa em tamanho ou abaixo de⁷. A quantidade de material de partida necessária para a preparação da grade e determinação da estrutura é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que outras técnicas de determinação de estrutura, como espectroscopia de ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios X ^4,5,6.

No entanto, um dos principais desafios para a determinação de estruturas por crio-EM envolve a preparação adequada da grade para obtenção de imagens. Um extenso estudo avaliando diversas amostras usando diferentes estratégias e grades de vitrificação sugeriu que a maioria das abordagens para vitrificação de amostras em grades crio-EM leva à aderência preferencial de macromoléculas à interface ar-água⁸. Essa adesão pode potencialmente causar quatro desfechos subótimos: (1) a amostra macromolecular desnatura completamente, caso em que nenhuma coleta e processamento de dados bem-sucedidos é possível; (2) a amostra desnatura parcialmente, caso em que pode ser possível obter insights estruturais de regiões da macromolécula que não estão danificadas; (3) a amostra mantém a estrutura nativa, mas apenas um conjunto de orientações de partículas relativas à direção do feixe de elétrons é representado nas imagens; (4) a amostra mantém a estrutura nativa, e algumas, mas não todas as possíveis orientações de partículas relativas à direção do feixe de elétrons são representadas nas imagens. Para os casos (3) e (4), a coleta de dados inclinada ajudará a minimizar a anisotropia de resolução direcional que afeta o mapa crio-EM reconstruído e fornecerá uma solução generalizável para uma ampla variedade de amostras⁹. Tecnicamente, a inclinação também pode beneficiar o caso (2), uma vez que a desnaturação presumivelmente ocorre na interface ar-água e da mesma forma limita o número de orientações distintas representadas nos dados. A extensão do viés de orientação no conjunto de dados pode ser potencialmente alterada pela experimentação de aditivos de solução, mas a falta de ampla aplicabilidade dificulta essas abordagens de tentativa e erro. A inclinação do estágio do espécime em um único ângulo de inclinação otimizado é suficiente para melhorar a distribuição das orientações em virtude da alteração da geometria do experimento de imagem⁹ (Figura 1). Devido à configuração geométrica da amostra preferencialmente orientada em relação ao feixe de elétrons, para cada aglomerado de orientações preferenciais, a inclinação da grade gera um cone de ângulos de iluminação em relação ao centroide do aglomerado. Assim, isso espalha as vistas e, consequentemente, melhora a amostragem do espaço de Fourier e a isotropia da resolução direcional.

Há, na prática, alguns prejuízos para inclinar o palco. A inclinação do estágio da amostra introduz um gradiente de foco em todo o campo de visão, o que pode afetar a precisão das estimativas da função de transferência de contraste (CTF). A coleta de dados inclinada também pode levar ao aumento do movimento de partículas induzido pelo feixe causado pelo aumento dos efeitos de carga ao obter imagens de amostras inclinadas. A inclinação da grade também leva a um aumento na espessura aparente do gelo, o que, por sua vez, leva a micrografias mais ruidosas e pode, em última instância, afetar a resolução das reconstruções 5,9,10. Talvez seja possível superar essas questões aplicando esquemas computacionais avançados de processamento de dados que são brevemente descritos nas seções de protocolo e discussão. Por fim, a inclinação pode levar ao aumento da sobreposição de partículas, dificultando o pipeline de processamento de imagens subsequente. Embora isso possa ser mitigado até certo ponto otimizando a concentração de partículas na rede, não deixa de ser uma consideração importante. Descreve-se aqui um protocolo de simples implementação para coleta de dados inclinados utilizando a suíte de software Leginon (software de aquisição automatizada de imagens), disponível em acesso aberto e compatível com uma ampla gama de microscópios^11,12,13,14. O método requer pelo menos a versão 3.0 ou superior, com as versões 3.3 em diante contendo melhorias dedicadas para permitir a coleta de dados inclinados. Nenhum software ou equipamento adicional é necessário para este protocolo. Instruções extensas sobre infraestrutura computacional e guias de instalação são fornecidas em outro lugar¹⁵.

Protocol

1. Preparação da amostra Use grades contendo folha de ouro e suporte de grade de ouro16 (ver Tabela de Materiais) porque a coleta de dados inclinada pode acentuar o movimento induzido pelo feixe17.OBS: Para o presente estudo, as amostras em grades foram vitrificadas pela técnica de imersão manual e blotting18 em câmara fria umidificada (maior que 80%) (~4 °C). Evitar o uso de grades cont…

Representative Results

A estimulação diafragmática por pressão diafragmática de 0,3 mg/mL foi usada para demonstrar imagens com inclinações de 0°, 30° e 60°. Dados de diferentes ângulos de inclinação foram coletados na mesma malha em diferentes regiões da grade. A resolução do CTF para inclinações angulares mais altas tende a ser pior, como foi o caso ao comparar os três conjuntos de dados neste estudo. A Figura 4 demonstra as imagens representativas comparativas e as médias de classificação …

Discussion

A orientação preferencial das partículas causada pela aderência do espécime à interface ar-água é um dos últimos grandes gargalos para a determinação rotineira de estruturas de alta resolução usando o SPA crio-EM ^4,5,6. O esquema de coleta de dados apresentado aqui fornece uma estratégia fácil de implementar para melhorar a distribuição de orientação das partículas dentro de um conjunto de dados. Ressaltamos …

Materials

Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01