JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Published: July 01, 2022
doi:
10.3791/64136
, , , ,
1Laboratory of Genetics,The Salk Institute for Biological Studies, 2Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics,The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Chemistry and Biochemistry,University of California San Diego, 4Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology,University of California San Diego, 5Department of Integrative Structural and Computational Biology,The Scripps Research Institute

Summary

Mevcut protokol, kriyo-EM deneylerinde eğimli tek parçacıklı veri toplama için genelleştirilmiş ve uygulanması kolay bir şemayı açıklamaktadır. Böyle bir prosedür, hava-su arayüzüne bağlılık nedeniyle tercihli oryantasyon yanlılığından muzdarip numuneler için yüksek kaliteli bir EM haritası elde etmek için özellikle yararlıdır.

Abstract

Kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) ile tek parçacık analizi (SPA) artık yüksek çözünürlüklü yapısal biyoloji için ana akım bir tekniktir. SPA ile yapı belirleme, ince bir buz tabakası içinde vitrifiye edilmiş bir makromoleküler nesnenin birden fazla farklı görünümünü elde etmeye dayanır. İdeal olarak, eşit olarak dağılmış rastgele projeksiyon yönelimlerinin bir koleksiyonu, nesnenin tüm olası görünümlerine karşılık gelir ve izotropik yönlü çözünürlük ile karakterize edilen rekonstrüksiyonlara yol açar. Bununla birlikte, gerçekte, birçok örnek, hava-su arayüzüne yapışan tercihli olarak yönlendirilmiş parçacıklardan muzdariptir. Bu, veri kümesinde düzgün olmayan açısal yönelim dağılımlarına ve rekonstrüksiyonda homojen olmayan Fourier uzayı örneklemesine yol açarak, anizotropik çözünürlük ile karakterize edilen haritalara çevrilir. Numune aşamasının eğilmesi, oryantasyon dağılımlarının homojenliğini ve dolayısıyla Fourier uzay örneklemesinin izotropisini geliştirerek çözünürlük anizotropisinin üstesinden gelmek için genelleştirilebilir bir çözüm sağlar. Mevcut protokol, otomatik görüntü toplama için bir yazılım olan Leginon’u kullanarak eğimli aşamalı bir otomatik veri toplama stratejisini açıklamaktadır. Prosedürün uygulanması basittir, herhangi bir ek ekipman veya yazılım gerektirmez ve biyolojik makromolekülleri görüntülemek için kullanılan çoğu standart iletim elektron mikroskobu (TEM) ile uyumludur.

Introduction

Son on yılda doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkışı 1,2,3, tek parçacıklı kriyo-EM 4,5,6 kullanılarak çözülen makromoleküllerin ve makromoleküler montajların yüksek çözünürlüklü yapılarının sayısında üstel bir artışa neden olmuştur. Hemen hemen tüm saflaştırılmış makromoleküler türlerin, ~ 10 kDa boyutunda veya7’nin altındaki en küçük proteinler hariç, kriyo-EM kullanılarak yapı tayinine uygun olması beklenir. Izgara hazırlama ve yapı belirleme için gereken başlangıç malzemesi miktarı, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve X-ışını kristalografisi 4,5,6 gibi diğer yapı belirleme tekniklerinden en az bir büyüklük sırası daha azdır.

Bununla birlikte, kriyo-EM ile yapı tayini için temel bir zorluk, görüntüleme için uygun ızgara hazırlığını içerir. Farklı vitrifikasyon stratejileri ve ızgaraları kullanarak çeşitli numuneleri değerlendiren kapsamlı bir çalışma, kriyo-EM ızgaralarındaki numuneleri vitrifiye etmek için çoğu yaklaşımın, makromoleküllerin hava-su arayüzüne tercihli olarak yapışmasına yol açtığını göstermiştir8. Bu tür bir bağlılık potansiyel olarak dört optimal olmayan sonuca neden olabilir: (1) makromoleküler numune tamamen denatüre olur, bu durumda başarılı bir veri toplama ve işleme mümkün değildir; (2) numune kısmen denatüre olur, bu durumda makromolekülün zarar görmemiş bölgelerinden yapısal bilgiler elde etmek mümkün olabilir; (3) numune doğal yapıyı korur, ancak görüntülerde elektron ışınının yönüne göre sadece bir parçacık oryantasyonu seti temsil edilir; (4) numune doğal yapısını korur ve elektron ışınının yönüne göre olası parçacık oryantasyonlarının bazıları ancak hepsi değil, bazıları görüntülerde temsil edilir. (3) ve (4) numaralı durumlar için, eğik veri toplama, yeniden yapılandırılmış kriyo-EM haritasını etkileyen yönlü çözünürlüklü anizotropinin en aza indirilmesine yardımcı olacak ve çok çeşitli örnekler için genelleştirilebilir bir çözüm sağlayacaktır9. Teknik olarak, eğme aynı zamanda duruma da fayda sağlayabilir (2), çünkü denatürasyon muhtemelen hava-su arayüzünde meydana gelir ve benzer şekilde verilerde temsil edilen farklı yönelimlerin sayısını sınırlar. Veri kümesindeki oryantasyon yanlılığının kapsamı, çözüm katkı maddeleri ile deneyler yapılarak potansiyel olarak değiştirilebilir, ancak geniş uygulanabilirlik eksikliği bu deneme yanılma yaklaşımlarını engellemektedir. Numune aşamasının optimize edilmiş tek bir eğme açısında eğilmesi, görüntüleme deneyi9’un geometrisini değiştirerek oryantasyonların dağılımını iyileştirmek için yeterlidir (Şekil 1). Tercihli yönelimli numunenin elektron ışınına göre geometrik konfigürasyonu nedeniyle, tercihli yönelimlerin her kümesi için, ızgaranın eğilmesi, küme sentroidine göre bir aydınlatma açıları konisi oluşturur. Bu nedenle, bu görüşleri yayar ve sonuç olarak Fourier uzay örneklemesini ve yönlü çözünürlüğün izotropisini geliştirir.

Pratikte, sahneyi eğmenin bazı zararları vardır. Numune aşamasının eğilmesi, görüş alanı boyunca kontrast aktarım işlevi (CTF) tahminlerinin doğruluğunu etkileyebilecek bir odak gradyanı oluşturur. Eğik veri toplama, eğik örnekleri görüntülerken artan şarj efektlerinin neden olduğu ışın kaynaklı parçacık hareketinin artmasına da neden olabilir. Izgara eğimi ayrıca görünür buz kalınlığında bir artışa yol açar, bu da daha gürültülü mikrograflara yol açar ve sonuçta rekonstrüksiyonların çözünürlüğünü etkileyebilir 5,9,10. Protokol ve tartışma bölümlerinde kısaca açıklanan gelişmiş hesaplamalı veri işleme şemalarını uygulayarak bu sorunların üstesinden gelmek mümkün olabilir. Son olarak, eğme, parçacık üst üste binmesinin artmasına neden olabilir ve sonraki görüntü işleme boru hattını engelleyebilir. Bu, şebeke üzerindeki parçacık konsantrasyonunu optimize ederek bir dereceye kadar azaltılabilse de, yine de önemli bir husustur. Burada, Leginon yazılım paketi (otomatik bir görüntü alma yazılımı), mevcut açık erişim ve çok çeşitli mikroskoplarla uyumlu11,12,13,14 kullanılarak eğimli veri toplama için uygulanması kolay bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, en az sürüm 3.0 veya üstünü gerektirir ve 3.3’ten sonraki sürümler, eğimli veri toplamayı etkinleştirmek için özel iyileştirmeler içerir. Bu protokol için ek bir yazılım veya ekipman gerekmez. Hesaplama altyapısı ve kurulum kılavuzları hakkında kapsamlı talimatlar başka bir yerde verilmiştir15.

Protocol

1. Numune hazırlama Altın folyo ve altın ızgara desteği16 içeren ızgaralar kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) çünkü eğimli veri toplama ışın kaynaklı hareketivurgulayabilir 17.NOT: Bu çalışma için, ızgaralar üzerindeki örnekler, nemlendirilmiş (% 80’den fazla) soğuk bir odada (~ 4 ° C) manuel daldırma ve lekeleme tekniği18 kullanılarak vitrifiye edilmiştir. Kesinlikl…

Representative Results

0.3 mg/mL’de DPS, 0°, 30° ve 60° eğimlerde görüntülemeyi göstermek için kullanıldı. Farklı eğim açılarından elde edilen veriler, farklı ızgara bölgelerinde aynı ızgarada toplanmıştır. CTF çözünürlüğü, bu çalışmada üç veri kümesini karşılaştırırken olduğu gibi, daha yüksek açılı eğimlere uyar ve daha zayıf olma eğilimindedir. Şekil 4 , karşılaştırmalı temsili görüntüleri ve 2B sınıflandırma ortalamalarını göstermektedir. Protein…

Discussion

Numunenin hava-su arayüzüne yapışmasından kaynaklanan tercih edilen parçacık oryantasyonu, cryo-EM SPA 4,5,6 kullanılarak rutin yüksek çözünürlüklü yapı belirleme işleminin son büyük darboğazlarından biridir. Burada sunulan veri toplama şeması, bir veri kümesi içindeki parçacıkların oryantasyon dağılımını iyileştirmek için uygulanması kolay bir strateji sağlar. Protokolün ek ekipman veya yaz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bill Anderson, Charles Bowman ve Jean-Christophe Ducom’a (TSRI) mikroskopi, Leginon kurulumları ve veri aktarım altyapısı ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Gordon Louie (Salk Enstitüsü) ve Yong Zi Tan’a (Singapur Ulusal Üniversitesi) el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Chris Russo’ya (MRC Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, Cambridge) DPS’nin ekspresyonu için bize plazmid sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (U54AI150472, U54 AI170855 ve R01AI136680’den DL’ye), Ulusal Bilim Vakfı’ndan (NSF MCB-2048095’ten DL’ye), Hearst Vakıfları’ndan (DL’ye) ve Arthur ve Julie Woodrow Kürsüsü’nden (J. P. N.’ye) gelen hibelerle desteklenmiştir.

Materials

Cryosparc Live v3.1.0+210216 Structura Biotechnology
DPS protein Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector Gatan
Leginon software suite C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids Quantifoil N1-A14nAu30-01
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
  3. Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
  5. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  6. Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
  7. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  8. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
  9. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  10. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  11. Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  12. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  13. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  14. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  15. . NYSBC.org Homepage Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022)
  16. Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
  17. Russo, C. J., Henderson, R. Charge accumulation in electron cryomicroscopy. Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).
  18. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
  22. Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. . cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).
  23. Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
  24. Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
  25. Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
  26. Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
  27. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  28. . Structura Biotechnology Inc Available from: https://cryosparc.com/live (2022)
  29. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  30. Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
  31. Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
  32. Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. . cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).
  33. Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading). Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).

Tags

Cryo-EMSingle-particle AnalysisStage TiltParticle OrientationData CollectionEucentric HeightImage ShiftFocusHole FindingAutomated Targeting
check_url/64136?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Aiyer, S., Strutzenberg, T. S., Bowman, M. E., Noel, J. P., Lyumkis, D. Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon. J. Vis. Exp. (185), e64136, doi:10.3791/64136 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image