I metodi immunoistochimici sono utili nella ricerca sulle api per rilevare e valutare il livello di apoptosi e necrosi nell'intestino medio e nelle ghiandole ipofaringee delle api adulte.
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Articolo metodologico
Nozioni di base sull'istologia e rilevamento della morte cellulare nel tessuto delle api
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le api mellifere (Apis mellifera L.) all'interno dell'alveare (lavoratrici nutrici e altre api dell'alveare) e all'esterno dell'alveare (raccoglitrici) sono esposte ai cambiamenti climatici e climatici, vari pesticidi, agenti patogeni e malnutrizione, entrando principalmente attraverso la bocca e colpendo principalmente i tratti digestivi delle api adulte. Per comprendere e prevenire gli effetti di tali fattori di stress esterni e interni sulle api, un utile metodo di ricerca è il metodo immunoistochimico. Viene descritto un protocollo di base per preparare l'intestino medio (ventricolo) e le ghiandole ipofaringee (HPG) delle api adulte per l'analisi istologica. Viene descritta una metodologia dettagliata per valutare il livello di danno cellulare e distinguere la necrosi dalla morte cellulare programmata (apoptosi) come processo naturale di rigenerazione dei tessuti. Vengono presentati i risultati del trattamento delle api adulte con acido ossalico e pesticidi (insetticida e acaricida) e la determinazione della morte cellulare nel ventricolo e negli HPG. Vengono inoltre discussi i pro e i contro della metodologia.
Introduzione
Le api mellifere (Apis mellifera L.) sono, tra gli altri impollinatori selvatici, i più importanti impollinatori delle piante agricole. Nel corso di migliaia di anni, l'ambiente mutevole ha influenzato le api ad adattare la loro morfologia, fisiologia, comportamento e tolleranza a diversi agenti patogeni e parassiti. Pertanto, le api hanno sviluppato una gamma molto diversificata di specie e sottospecie in tutto il mondo1. Questi risultati sono coerenti con i risultati precedenti, che c'è una variazione genetica nella struttura del tratto digestivo dell'ape, ma suggeriscono anche che le alterazioni dell'intestino medio sono dovute a fa....
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Protocollo
1. Istologia di base per la ricerca sulle api
- Dissezione del tessuto delle api
NOTA: Per la dissezione delle api operaie, utilizzare un microscopio da dissezione con una sorgente luminosa a LED. L'ingrandimento più utile è ~ 20x.- Manipolazione e dissezione
- Prendere con cautela un'ape operaia con una pinza e metterla sul ghiaccio (o nel congelatore a -20 ° C) per 2 minuti per immobilizzarla22. Appuntare l'ape sulla piastra di Petri diagonalmente attraverso la parte posteriore superiore del torace due volte, da sinistra a destra e da destra a sinistra.
- Versare soluzione salina per insetti pe....
- Manipolazione e dissezione
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Risultati
Rilevamento della morte cellulare nel midgut
Le api operaie appena emerse (Apis mellifera carnica) dall'apiario sperimentale dell'Istituto agricolo sloveno di Lubiana sono state trattate individualmente con acido ossalico (OA) al 3%. L'OA è spesso usato in apicoltura per il controllo del distruttore di Varroa . Dopo il trattamento, le api operaie (tre per ogni gruppo) sono state immobilizzate sul ghiaccio. Il midgut è stato sezionato e fissato in formalina al .......
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Discussione
Negli organismi viventi, la morte cellulare è definita come apoptosi o necrosi25 e può essere accompagnata da autofagia26. La differenza tra cellule apoptotiche e necrotiche è che l'apoptosi è una forma di morte cellulare programmata e appare nelle cellule normali, mentre la necrosi si verifica a causa di condizioni letali (ad esempio, incidente, malattia)27,28. L'apoptosi può essere rilevata utilizzando kit di anal.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Riconosco con gratitudine il sostegno dell'Agenzia di ricerca slovena, sovvenzione n. P4-133.
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Materiali
24
distillataper inclusione Kit alcolico per microscopio Leica La Microtomo Leica Stazione modulare per l'inclusione dei tessuti Leica NaHPO Paraplast Leica Piastra di Petri PBS per acquerello
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit 2-propanolo | |||
| ApopTag perossidasi (ApopTag Perossidasi In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Controlli positivi inclusi in S7101 |
| Coperture | |||
| Vicolo cieco Sistema colorimetrico TUNEL | Promega | G7360 | Saggio A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Microscopio da dissezione (per la dissezione delle api) | Zeiss | ||
| Acqua | |||
| Cassetta | |||
| fosfatasi alcalina EnVision System | Dako | ||
| Eosin Y Soluzione | Sigma-Aldrich | Etanolo | |
| 95% (o meno puro), 90%, 80% | |||
| Faramount mezzo di montaggio, acquoso | Dako | supporto medio | |
| Tavolo di appiattimento | Leica | HI1220 | |
| Pinze (per la dissezione delle api) | Strumenti per la scienza | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalina 10% | Formaldeide | ||
| Ematossilina | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Agente di compensazione | Sigma-Aldrich | Agente di pulizia | |
| Idrogeno perossidasi 3% | |||
| Incubatrice | BioRad | ||
| Spilli per insetti (per la dissezione delle api) | Entosphinx | 44594 | Perni per insetti in acciaio inossidabile - bianco, misura 2 |
| ISCDDK, AP (Kit di rilevamento della morte cellulare in situ, fosfatasi alcalina) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Microscopio ottico | Vetrini | ||
| scatola con i vetrini deve essere conservata in un involucro di plastica per evitare la polvere | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldeide 4% | |||
| Pipette | |||
| Pasteur | 1,5 mL; 3 mL | ||
| (per la dissezione delle api) | Riempito con silicone di condensazione (Xantoprene L blu e Universal liquid plus attivatore) | ||
| Proteinasi K | Merck | 21627 | |
| Soluzione di Ringers (per la dissezione delle api) | 7,5 g di NaCL, 2,38 g di Na2HPO4, 2,72 g di KH2PO4, 1 L di acqua distillata | ||
| (per la dissezione delle api) | Strumenti per la scienza fine | 1406-09, 14061-09 | Dritto e curvo, 9 cm |
| Liquido universale più attivatore (per la dissezione delle api) | Orologiaio Kulzer | ||
| ' s pinza (per la dissezione delle api) | Strumenti per le scienze fini | 91100-12 | |
| Bagno d'acqua | Leica | ||
| Pennello | 2x | ||
| Xantoprene L blu (per la dissezione delle api) | Kulzer |
Riferimenti
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee.
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Ristampe e permessi
