In vitro Digestão de emulsões em uma única gotícula via troca multifásica de fluidos gastrointestinais simulados

Summary

Um balanço de filme de superfície de gota pendente implementado com uma troca multi-subfase, apelidada de OCTOPUS, permite imitar condições digestivas pela troca subfásica sequencial da solução a granel original com fluidos gastrointestinais simulados. A digestão in vitro simulada é monitorada registrando in situ a tensão interfacial da camada interfacial digerida.

Abstract

As emulsões estão sendo usadas atualmente para encapsular e fornecer nutrientes e medicamentos para combater diferentes condições gastrointestinais, como obesidade, fortificação de nutrientes, alergias alimentares e doenças digestivas. A capacidade de uma emulsão de fornecer a funcionalidade desejada, ou seja, atingir um local específico dentro do trato gastrointestinal, inibir / retardar a lipólise ou facilitar a digestibilidade, depende em última análise de sua suscetibilidade à degradação enzimática no trato gastrointestinal. Em emulsões de óleo em água, as gotículas lipídicas são cercadas por camadas interfaciais, onde os emulsificantes estabilizam a emulsão e protegem o composto encapsulado. Alcançar uma digestibilidade personalizada das emulsões depende de sua composição inicial, mas também requer o monitoramento da evolução dessas camadas interfaciais, pois elas são submetidas a diferentes fases da digestão gastrointestinal. Um balanço de filme de superfície de gota pendente implementado com uma troca multi-subfásica permite simular a digestão in vitro de emulsões em uma única gota aquosa imersa em óleo, aplicando um modelo de digestão estática personalizado. O trânsito através do trato gastrointestinal é imitado pela troca subfásica da solução original em massa de gotículas com meios artificiais, imitando as condições fisiológicas de cada compartimento/etapa do trato gastrointestinal. A evolução dinâmica da tensão interfacial é registrada in situ ao longo de toda a digestão gastrointestinal simulada. As propriedades mecânicas das interfaces digeridas, como elasticidade dilatacional interfacial e viscosidade, são medidas após cada fase de digestão (oral, gástrica, intestino delgado). A composição de cada meio digestivo pode ser ajustada para explicar as particularidades das condições digestivas, incluindo patologias gastrointestinais e meios digestivos infantis. Os mecanismos interfaciais específicos que afetam a proteólise e a lipólise são identificados, fornecendo ferramentas para modular a digestão pela engenharia interfacial de emulsões. Os resultados obtidos podem ser manipulados para projetar novas matrizes alimentares com funcionalidades personalizadas, como baixa alergenicidade, ingestão controlada de energia e diminuição da digestibilidade.

Introduction

Entender como a gordura é digerida, o que envolve a digestão em emulsão, é importante para projetar racionalmente produtos com funcionalidade personalizada¹. O substrato para a digestão de gordura é uma emulsão, uma vez que a gordura é emulsionada após o consumo por ação mecânica e mistura com biossurfactantes na boca e no estômago. Além disso, a maior parte da gordura consumida pelos seres humanos já é emulsionada (como produtos lácteos) e, no caso de bebês ou alguns idosos, essa é a única forma de consumo. Assim, o design de produtos à base de emulsão com perfis de digestão específicos é muito importante na nutrição¹. Além disso, as emulsões podem encapsular e fornecer nutrientes, medicamentos ou bioativos lipofílicos² para lidar com diferentes condições gastrointestinais, como obesidade³, fortificação de nutrientes, alergias alimentares e doenças digestivas. Nas emulsões de óleo em água, as gotículas lipídicas são cercadas por camadas interfaciais de emulsificantes, como proteínas, surfactantes, polímeros, partículas e misturas⁴. O papel dos emulsificantes é duplo: estabilizar a emulsão⁵ e proteger/transportar o composto encapsulado para um local específico. A obtenção de uma digestibilidade personalizada das emulsões depende de sua composição inicial, mas também requer o monitoramento da evolução contínua dessa interface durante o trânsito pelo trato gastrointestinal (Figura 1).

Figura 1: Aplicando engenharia interfacial de emulsões para lidar com algumas das principais condições gastrointestinais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A digestão lipídica é, em última análise, um processo interfacial, pois requer a adsorção de lipases (gástricas ou pancreáticas) na interface óleo-água de gotículas lipídicas emulsionadas através da camada interfacial para alcançar e hidrolisar os triglicerídeos contidos no óleo em ácidos graxos livres e monoacilglicerídeos⁶. Isso está esquematizado na Figura 2. A lipase gástrica compete com a pepsina e os fosfolipídios no estômago pela interface óleo-água (Figura 2, digestão gástrica). Em seguida, a lipase/colipase pancreática compete com tripsina/quimotripsina, fosfolipídios, sais biliares e produtos digestivos no intestino delgado. As proteases podem alterar a cobertura interfacial, prevenindo ou favorecendo a adsorção da lipase, enquanto os sais biliares são altamente ativos superficiais e deslocam a maior parte do emulsificante restante para promover a adsorção da lipase (Figura 2, digestão intestinal). Eventualmente, a taxa e a extensão da lipólise dependem das propriedades interfaciais da emulsão digerida inicial/gástrica, como a espessura, as conexões inter/intramoleculares e as interações eletrostáticas e estéricas. Assim, o monitoramento da evolução da camada interfacial à medida que é digerida oferece uma plataforma experimental para identificar mecanismos e eventos interfaciais que afetam a adsorção da lipase e, portanto, a digestão lipídica.

Figura 2: Diagrama esquemático ilustrando o papel das interfaces na digestão lipídica gastrointestinal. A hidrólise da pepsina altera a composição interfacial na fase gástrica, enquanto a lipase gástrica hidrolisa os triglicerídeos. No intestino delgado, a tripsina/quimotripsina hidrolisa ainda mais o filme interfacial, enquanto a lipólise prossegue pela adsorção de BS/lipases, pela hidrólise de triglicerídeos e pela dessorção de produtos lipolíticos por solubilização nas micelas/complexo BS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O equipamento de gota de pingente da Universidade de Granada (UGR) é implementado com uma tecnologia patenteada, o duplo capilar coaxial, que permite a troca subfásica da solução a granel⁷. O capilar, que contém a gota do pingente, consiste em um arranjo de dois capilares coaxiais que são conectados independentemente a cada canal de um microinjetor duplo. Cada microinjetor pode operar de forma independente, permitindo a troca do conteúdo caído pelo fluxo⁷. Assim, a troca subfásica consiste na injeção simultânea da nova solução com o capilar interno e na extração da solução a granel com o capilar externo usando a mesma taxa de fluxo. Este processo permite a substituição da solução a granel sem perturbação da área interfacial ou do volume da gota. Este procedimento foi posteriormente atualizado para uma troca multi-subfase, que permite até oito trocas subfásicas sequenciais da solução a granel de gotículas⁸. Isso permite a simulação do processo digestivo em uma única gota aquosa suspensa em meio lipídico, trocando sequencialmente a solução a granel por meios artificiais imitando os diferentes compartimentos (boca, estômago, intestino delgado). Toda a configuração é representada na Figura 3, incluindo os detalhes dos componentes. As seringas do microinjetor são conectadas às oito válvulas vias, cada uma conectando-se a um tubo de microcentrífuga contendo o fluido digestivo artificial com componentes descritos na Figura 2.

Figura 3: Visão geral do OCTOPUS com todos os componentes. A câmera CCD, o microscópio, o microposicionador, a célula termoestabilizada e o capilar duplo foram conectados independentemente a um microinjetor duplo com duas seringas conectadas a oito válvulas vias. Cada seringa se conecta com capilares, quatro tubos de microcentrífuga com amostra e uma descarga. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 4A mostra como cada um dos fluidos digestivos artificiais é injetado na gota pendente por troca de subfases através do duplo capilar. Cada composto digestivo detalhado na Figura 2 pode ser aplicado simultaneamente/sequencialmente, simulando a passagem pelo trato gastrointestinal. Os fluidos digestivos artificiais contêm diferentes enzimas e biossurfactantes, que alteram a tensão interfacial do emulsificante inicial, conforme esquematizado na Figura 4B. O software DINATEN (ver Tabela de Materiais), também desenvolvido na UGR, registra a evolução da tensão interfacial em tempo real à medida que a camada interfacial inicial é digerida in vitro. Além disso, após cada fase digestiva, a elasticidade dilatacional da camada interfacial é calculada impondo oscilações periódicas de volume/área interfacial na camada interfacial estabilizada e registrando a resposta da tensão interfacial. O período/frequência e a amplitude da oscilação podem ser variados, e o processamento da imagem com o software CONTACTO fornece os parâmetros reológicos dilatacionais⁸.

Figura 4: Exemplos de perfis de digestão . (A) A camada emulsificante inicial é submetida a meio digestivo artificial colocado na microcentrífuga por troca subfásica sequencial das diferentes soluções na gota pendente. (B) A evolução geral da tensão interfacial (eixo y) do emulsionante inicial em função do tempo (eixo x) à medida que é digerido in vitro pelas várias enzimas/biossurfactantes nos meios artificiais. Uma troca subfásica final com fluido intestinal simples mede a dessorção de lipídios digeridos por solubilização em micelas mistas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este estudo apresenta o protocolo geral desenhado para medir a digestão in vitro de camadas interfaciais com equipamento de gota pendente⁹. A camada interfacial inicial é submetida sequencialmente a condições que imitam a passagem pelo trato gastrointestinal, conforme ilustrado na Figura 2. Esses diferentes meios digestivos são injetados na gota pendente por troca subfásica das diferentes soluções contidas nos tubos de microcentrífuga (Figura 4A). A composição desses meios pode ser personalizada dependendo das condições gastrointestinais que serão avaliadas, a saber, proteólise/lipólise gástrica/intestinal, permitindo mensurar efeitos cumulativos e sinergias¹⁰. As condições experimentais utilizadas para mimetizar o processo de digestão em cada compartimento seguem o protocolo de consenso internacional publicado pelo INFOGEST detalhando o pH e as quantidades de eletrólitos e enzimas¹¹. O dispositivo experimental baseado na gota pendente permite o registro da tensão interfacial in situ durante todo o processo de digestão simulado. A reologia dilatacional da camada interfacial é calculada no final de cada etapa digestiva. Dessa forma, cada emulsificante oferece um perfil de digestão que ilustra as propriedades das interfaces digeridas, conforme ilustrado na Figura 4B. Isso permite a extração de conclusões sobre sua suscetibilidade ou resistência às diferentes etapas do processo digestivo. Em geral, o meio digestivo artificial contém pH ácido/básico, eletrólitos, proteases (gástricas e intestinais), lipases (gástricas e intestinais), sais biliares e fosfolipídios, que são dissolvidos em seus respectivos fluidos digestivos (gástrico ou intestinal). A Figura 4B mostra um perfil genérico da evolução da tensão interfacial de um emulsificante, primeiro submetido à ação da protease, seguido pelas lipases. Em geral, a proteólise da camada interfacial promove um aumento da tensão interfacial devido à dessorção de peptídeos hidrolisados^9,12, enquanto a lipólise resulta em uma redução muito acentuada da tensão interfacial devido à adsorção de sais biliares e lipases ¹³. Uma troca subfásica final com o fluido intestinal esgota a solução a granel de material não adsorvido/digerido e promove a dessorção de compostos solúveis e a solubilização de lipídios digeridos em micelas mistas. Isso é quantificado pelo aumento da tensão interfacial registrada (Figura 4B).

Em resumo, o delineamento experimental implementado na gota pendente para simular a digestão in vitro em uma única gota permite medir efeitos cumulativos e sinergias à medida que o processo de digestão é aplicado sequencialmente à camada interfacial inicial¹⁰. A composição de cada meio digestivo pode ser facilmente ajustada para dar conta das particularidades das condições digestivas, incluindo patologias gastrointestinais ou meios digestivos infantis¹⁴. Em seguida, a identificação dos mecanismos interfaciais que afetam a proteólise e a lipólise pode ser usada para modular a digestão pela engenharia interfacial de emulsões. Os resultados obtidos podem ser aplicados no desenho de novas matrizes alimentares com funcionalidades sob medida, como baixa alergenicidade, ingestão controlada de energia e digestibilidade diminuída 15,16,17,18,19.

Protocol

1. Sequência de limpeza para todos os artigos de vidro utilizados na experimentação da ciência da superfície Esfregue os copos com uma solução de limpeza concentrada (ver Tabela de Materiais) diluída em água (10%). Enxágue bem com uma sequência de água da torneira, propanol, água destilada e água ultrapura. Seque em uma cabine e armazene em um armário fechado até o uso. 2. Preparação da amostra <ol…

Representative Results

Esta seção mostra diferentes exemplos de perfis de digestão medidos com o OCTOPUS. A aparência geral das correspondências de perfil de digestão simuladas é mostrada na Figura 4B. A tensão interfacial é geralmente representada contra o tempo no perfil de digestão. As diferentes fases/etapas de digestão consideradas são representadas em diferentes cores. A primeira fase forma a camada inicial e corresponde à fase de adsorção do emulsionante ou proteína/surfactante/polímero, de…

Discussion

Este artigo descreve um protocolo generalizado para medir a digestão in vitro de camadas interfaciais usando equipamentos de gota pendente. O protocolo pode ser ajustado às necessidades específicas do experimento ajustando a composição dos tampões digestivos, que são baseados no protocolo harmonizado INFOGEST^11,20 para facilitar a comparação com a literatura. As enzimas digestivas e os biossurfactantes podem ser adicionados individualmente, sequ…

Materials

Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	C4129	Enzyme
Beta-lactoglobulin	Sigma-Aldrich	L0130	Emulsfier
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Emulsfier
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Electrolyte
Centrifuge	Kronton instruments	Centrikon T-124	For separating oil and resins
Citrus pectin	Sigma-Aldrich	P9135	Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS	Sigma	C3028	Enzyme
CONTACTO	University of Granada (UGR)		https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN	University of Granada (UGR)		https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase	Lipolytech	RGE15-1G	Enzyme
Human Serum Albumin	Sigma-Aldrich	70024-90-7	Emulsifier
INFOGEST			http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II	Sigma-Aldrich	L33126	Enzyme
Magnesium metasilicate resins	Fluka	1343-88-0	Resins to purify oil
Micro 90	International products	M-9051-04	Cleaner
NaCl	Sigma	7647-14-5	Electrolyte
NaH2PO4	Scharlau	10049-21-5	To prepare buffer
OCTOPUS	Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain)		Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil	Sigma-Aldrich	1514	oil
Pancreatic from porcine pancreas	Sigma	P7545-25 g	Enzyme
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887	Enzyme
Pluronic F127	Sigma	P2443	Emulsifier
Pluronic F68	Sigma	P1300	Emulsfier
Sodium deoxycholate	Sigma		Bile salts
Sodium glycodeoxycholate	Sigma	C9910	Bile salts
Sodium taurocholate	Sigma	86339	Bile salts
Syringe Filter	Millex-DP	SLGP033R	Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426	Enzyme