In vivo Vaskulær permeabilitetsdetektion i mus submandibulær kirtel

Summary

I den nuværende protokol blev endotelbarrierefunktionen af den submandibulære kirtel (SMG) evalueret ved at injicere forskellige molekylærvægtede fluorescerende sporstoffer i vinkelårerne i forsøgsdyrmodeller in vivo under et to-foton laserscanningsmikroskop.

Abstract

Spyt spiller en vigtig rolle i oral og generel sundhed. Den intakte endotelbarrierefunktion af blodkar muliggør spytsekretion, mens endotelbarrieredysfunktionen er relateret til mange spytkirtelsekretoriske lidelser. Den nuværende protokol beskriver en in vivo paracellulær permeabilitetsdetekteringsmetode til evaluering af funktionen af endoteltætte kryds (TJ’er) i musens submandibulære kirtler (SMG). Først blev fluorescensmærkede dextraner med forskellige molekylvægte (4 kDa, 40 kDa eller 70 kDa) injiceret i musenes vinkelårer. Derefter blev den ensidige SMG dissekeret og fastgjort i den tilpassede holder under et to-foton laserscanningsmikroskop, og derefter blev der taget billeder til blodkar, acini og kanaler. Ved hjælp af denne metode blev den dynamiske lækage i realtid af sporstoffer af forskellig størrelse fra blodkar til de basale sider af acini og endda over acinar-epiteliaen ind i kanalerne overvåget for at evaluere ændringen af endotelbarrierefunktionen under fysiologiske eller patofysiologiske forhold.

Introduction

Forskellige spytkirtler producerer spyt, som primært fungerer som den første forsvarslinje mod infektioner og hjælper fordøjelsen og derved spiller en væsentlig rolle i oral og generel sundhed¹. Blodforsyning er afgørende for spytkirtelsekretion, da det konstant giver vand, elektrolytter og molekyler, der danner det primære spyt. Endotelbarrierefunktion, reguleret af det stramme kryds (TJ) kompleks, begrænser strengt og delikat gennemtrængningen af kapillærer, som er meget gennemtrængelige for vand, opløste stoffer, proteiner og endda celler, der bevæger sig fra de cirkulerende blodkar ind i spytkirtelvævet ^2,3. Vi har tidligere fundet ud af, at åbningen af endotel-TJ’erne som reaktion på en kolinerg stimulus letter spytsekretion, mens forringelsen af endotelbarrierefunktionen er forbundet med hyposekretion og lymfocytisk infiltration i de submandibulære kirtler (SMG’er) i Sjögrens syndrom⁴. Disse data tyder på, at bidraget fra endotelbarrierefunktionen skal være tilstrækkelig opmærksom på en række spytkirtelsygdomme.

Et to-foton laserscanningsmikroskop er et kraftfuldt værktøj til at observere dynamikken i celler i intakt væv in vivo. En af fordelene ved denne teknik er, at nær-infrarødt lys (NIR) har dybere vævsindtrængning end synligt eller ultraviolet lys, når prøver er ophidset af NIR og ikke forårsager åbenlys lysskade på væv under passende forhold ^5,6. Faktisk er spytkirtlerne et meget homogent og overfladisk væv, hvor overflade acinarcellerne kun er omkring 30 μm væk fra kirteloverfladen ^7,8. Det har vist sig, at intravital konfokal mikroskopi kan studere eksokrine sekretion og actin cytoskelet i levende musespytkirtler ved subcellulær opløsning⁸. To-foton laserscanningsmikroskopi har ikke desto mindre ikke kun fordelen ved konventionel konfokal mikroskopi, men kan også bruges til at detektere dybere væv og billede mere tydeligt. Her kan fluorescensmærket dextrans, der ofte bruges som paracellulære permeabilitetssporere og har fordelen ved forskellige størrelser, bruges til at teste størrelsen af TJ pore⁹. I denne undersøgelse er der etableret en intravital realtids to-foton laserscanningsmikroskopiteknik til in situ-evaluering af endotelbarrierefunktionen i muse-SMG’er. Hvert arbejdstrin til in vivo vaskulær permeabilitetsdetektion i muse-SMG’er er beskrevet i den nuværende protokol. Her er et eksempel på detektering af endotelbarrierefunktion i musens SMG-kanalligationsmodel.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Ethics Committee of Animal Research, Peking University Health Science Center, og overholdt vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr (NIH-publikation nr. 85-23, revideret 1996). Mandlige vildtype (WT) mus i aldersgruppen 8-10 uger blev brugt til denne undersøgelse. Forsøgsdyrene blev omhyggeligt behandlet for at minimere deres smerte og ubehag. 1. Dyreforsøg Forbered og administrer anæstetika og sporstoffer.<ol…

Representative Results

Efter protokollen blev den ensidige SMG fastgjort til en specialfremstillet holder, og kirtlen blev holdt så langt væk fra musekroppen som muligt for at forhindre vejrtrækning i at forårsage bevægelsesartefakter. Den hurtige strøm af de røde blodlegemer (sorte prikker) i blodkar blev observeret under mikroskopet. Efter at have fundet vævsfeltet under en okulær linse, skal man skifte for at manipulere mikroskopsoftwaren. I kontrolgruppen eksisterede begge sporstoffer i blodkarrene i musen SMG. Især på grund af …

Discussion

Vedligeholdelse og regulering af endotelbarrierefunktionen er afgørende for vaskulær homeostase. Endotelceller og deres intercellulære kryds spiller en afgørende rolle i opretholdelsen og kontrollen af vaskulær integritet¹². Forskydningskraften i blodgennemstrømning, vækstfaktorer og inflammatoriske faktorer kan forårsage ændringer i vaskulær permeabilitet og dermed deltage i forekomsten og udviklingen af systemiske sygdomme som hypertension, diabetes og autoimmune sygdomme<sup class="xr…

Materials

2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE)	Leica, Germany
4 kDa FITC-labeled dextran	Sigma Aldrich	46944
70 kDa rhodamine B-labeled dextran	Sigma Aldrich	R9379
Blunt tissue separation nickel	Bejinghuabo Company	NZW28
Depilatory cream	Veet
Disposable sterile syringe	Zhiyu Company		1 mL
Image J software	National Institutes of Health
Insulin syringe	Becton, Dickinson and Company	0253316	1 mL
Leica Application Suite X software	Leica Microsystems
Microtubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Phosphate buffered saline 1x	Servicebio	G4207-500
Tissue scissors	Bejinghuabo Company	M286-05
Tribromoethanol	JITIAN Bio	JT0781