In vivo Vasculaire permeabiliteitsdetectie bij submandibulaire klier van muizen
Summary
In dit protocol werd de endotheelbarrièrefunctie van de submandibulaire klier (SMG) geëvalueerd door verschillende moleculair gewogen fluorescerende tracers in vivo in de hoekaders van proefdiermodellen te injecteren onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen.
Abstract
Speeksel speelt een belangrijke rol in de mond- en algehele gezondheid. De intacte endotheelbarrièrefunctie van bloedvaten maakt speekselsecretie mogelijk, terwijl de disfunctie van de endotheelbarrière gerelateerd is aan veel secretoire stoornissen van de speekselklier. Het huidige protocol beschrijft een in vivo paracellulaire permeabiliteitsdetectiemethode om de functie van endotheel tight junctions (TJ’s) in submandibulaire klieren van muizen (SMG) te evalueren. Ten eerste werden fluorescentie-gelabelde dextrans met verschillende molecuulgewichten (4 kDa, 40 kDa of 70 kDa) geïnjecteerd in de hoekaders van muizen. Daarna werd de eenzijdige SMG ontleed en bevestigd in de aangepaste houder onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen en vervolgens werden beelden vastgelegd voor bloedvaten, acini en kanalen. Met behulp van deze methode werd de real-time dynamische lekkage van de tracers van verschillende grootte uit bloedvaten naar de basale zijden van de acini en zelfs over de acinaire epithelia in de kanalen gecontroleerd om de verandering van de endotheelbarrièrefunctie onder fysiologische of pathofysiologische omstandigheden te evalueren.
Introduction
Verschillende speekselklieren produceren speeksel, dat voornamelijk fungeert als de eerste verdedigingslinie tegen infecties en de spijsvertering helpt, waardoor het een essentiële rol speelt in de mond- en algehele gezondheid1. Bloedtoevoer is cruciaal voor speekselkliersecretie, omdat het constant water, elektrolyten en moleculen levert die het primaire speeksel vormen. Endotheelbarrièrefunctie, gereguleerd door het tight junction (TJ) -complex, beperkt strikt en delicaat de permeatie van haarvaten, die zeer doorlaatbaar zijn voor water, opgeloste stoffen, eiwitten en zelfs cellen die van de circulerende bloedvaten naar de speekselklierweefsels bewegen 2,3. We hebben eerder ontdekt dat het openen van de endotheel-TJ’s als reactie op een cholinerge stimulus speekselsecretie vergemakkelijkt, terwijl de aantasting van de endotheelbarrièrefunctie verband houdt met hyposecretie en lymfocytische infiltratie in de submandibulaire klieren (SMG’s) bij syndroom van Sjögren4. Deze gegevens suggereren dat de bijdrage van de endotheelbarrièrefunctie voldoende aandacht moet krijgen met betrekking tot een verscheidenheid aan speekselklieraandoeningen.
Een laserscanmicroscoop met twee fotonen is een krachtig hulpmiddel voor het observeren van de dynamiek van cellen in intact weefsel in vivo. Een van de voordelen van deze techniek is dat nabij-infrarood licht (NIR) een diepere weefselpenetratie heeft dan zichtbaar of ultraviolet licht wanneer monsters worden geëxciteerd door NIR en geen duidelijke lichtschade aan weefsels veroorzaakt onder de juiste omstandigheden 5,6. Inderdaad, de speekselklieren zijn een zeer homogeen en oppervlakkig weefsel, waarin de oppervlakte-acinaire cellen slechts ongeveer 30 μm verwijderd zijn van het klieroppervlak 7,8. Het is aangetoond dat intravitale confocale microscopie exocriene secretie en actinecytoskelet kan bestuderen in levende muis speekselklieren met subcellulaire resolutie8. Twee-fotonen laserscanmicroscopie heeft echter niet alleen het voordeel van conventionele confocale microscopie, maar kan ook worden gebruikt om dieper weefsel en beeld duidelijker te detecteren. Hier kan fluorescentie-gelabelde dextrans, die vaak worden gebruikt als paracellulaire permeabiliteitstracers en het voordeel hebben van verschillende groottes, worden gebruikt om de grootte van TJ-porie9 te testen. In de huidige studie wordt een intravitale real-time twee-fotonen laserscanmicroscopietechniek vastgesteld voor in situ evaluatie van de endotheelbarrièrefunctie in muizen-SMG’s. Elke werkstap voor in vivo vasculaire permeabiliteitsdetectie bij muis-SMG’s wordt beschreven in het huidige protocol. Hier is een voorbeeld van het detecteren van de endotheelbarrièrefunctie in het SMG-kanaalligatiemodel van de muis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het behoud en de regulatie van de endotheelbarrièrefunctie zijn essentieel voor vasculaire homeostase. Endotheelcellen en hun intercellulaire juncties spelen een cruciale rol bij het handhaven en beheersen van de vasculaire integriteit12. De schuifkracht van de bloedstroom, groeifactoren en ontstekingsfactoren kunnen veranderingen in de vasculaire permeabiliteit veroorzaken en dus deelnemen aan het optreden en de ontwikkeling van systemische ziekten zoals hypertensie, diabetes en auto-immuunziekt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidies 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 en 81974151) en de Beijing Natural Science Foundation (subsidie 7202082).
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
Riferimenti
- Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
- Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
- Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
- Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren’s syndrome. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
- Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
- Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
- Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
- Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
- Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
- Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470 (2020).
