In vivo Détection de perméabilité vasculaire dans la glande sous-maxillaire de souris
Summary
Dans le présent protocole, la fonction de barrière endothéliale de la glande sous-maxillaire (SMG) a été évaluée en injectant différents traceurs fluorescents pondérés moléculairement dans les veines angulaires de modèles animaux testés in vivo sous un microscope à balayage laser à deux photons.
Abstract
La salive joue un rôle important dans la santé bucco-dentaire et globale. La fonction de barrière endothéliale intacte des vaisseaux sanguins permet la sécrétion de salive, tandis que le dysfonctionnement de la barrière endothéliale est lié à de nombreux troubles sécrétoires des glandes salivaires. Le présent protocole décrit une méthode de détection de perméabilité paracellulaire in vivo pour évaluer la fonction des jonctions serrées endothéliales (TJ) dans les glandes sous-maxillaires de souris (SMG). Tout d’abord, des dextranes marqués par fluorescence avec différents poids moléculaires (4 kDa, 40 kDa ou 70 kDa) ont été injectés dans les veines angulaires de souris. Par la suite, le SMG unilatéral a été disséqué et fixé dans le support personnalisé sous un microscope à balayage laser à deux photons, puis des images ont été capturées pour les vaisseaux sanguins, les acini et les canaux. En utilisant cette méthode, la fuite dynamique en temps réel des traceurs de différentes tailles des vaisseaux sanguins dans les côtés basaux de l’acine et même à travers l’épithélium acineux dans les canaux a été surveillée pour évaluer l’altération de la fonction de barrière endothéliale dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques.
Introduction
Diverses glandes salivaires produisent de la salive, qui agit principalement comme première ligne de défense contre les infections et aide à la digestion, jouant ainsi un rôle essentiel dans la santé bucco-dentaire et globale1. L’approvisionnement en sang est crucial pour la sécrétion des glandes salivaires car il fournit constamment de l’eau, des électrolytes et des molécules qui forment la salive primaire. La fonction barrière endothéliale, régulée par le complexe de la jonction serrée (TJ), limite strictement et délicatement la perméation des capillaires, qui sont hautement perméables à l’eau, aux solutés, aux protéines et même aux cellules se déplaçant des vaisseaux sanguins circulants dans les tissus des glandes salivaires 2,3. Nous avons précédemment constaté que l’ouverture des TJ endothéliaux en réponse à un stimulus cholinergique facilite la sécrétion de salive, alors que l’altération de la fonction de barrière endothéliale est liée à l’hyposécrétion et à l’infiltration lymphocytaire dans les glandes sous-maxillaires (SMG) dans le syndrome de Sjögren4. Ces données suggèrent que la contribution de la fonction de barrière endothéliale doit être suffisamment prise en compte en ce qui concerne une variété de maladies des glandes salivaires.
Un microscope à balayage laser à deux photons est un outil puissant pour observer la dynamique des cellules dans les tissus intacts in vivo. L’un des avantages de cette technique est que la lumière proche infrarouge (NIR) a une pénétration tissulaire plus profonde que la lumière visible ou ultraviolette lorsque les échantillons sont excités par le NIR et ne provoque pas de dommages évidents aux tissus par la lumière dans des conditions appropriées 5,6. En effet, les glandes salivaires sont un tissu très homogène et superficiel, dans lequel les cellules acineuses de surface ne sont qu’à environ 30 μm de la surface de la glande 7,8. Il a été démontré que la microscopie confocale intravitale peut étudier la sécrétion exocrine et le cytosquelette d’actine dans les glandes salivaires de souris vivantes à une résolution subcellulaire8. Néanmoins, la microscopie à balayage laser à deux photons présente non seulement l’avantage de la microscopie confocale conventionnelle, mais peut également être utilisée pour détecter plus clairement les tissus et les images plus profonds. Ici, les dextrans marqués par fluorescence, qui sont fréquemment utilisés comme traceurs de perméabilité paracellulaire et ont l’avantage de différentes tailles, peuvent être utilisés pour tester l’ampleur du pore TJ9. Dans la présente étude, une technique de microscopie intravitale à balayage laser à deux photons en temps réel est établie pour l’évaluation in situ de la fonction de barrière endothéliale chez les SMG de souris. Chaque étape de travail pour la détection in vivo de la perméabilité vasculaire chez les SMG de souris est décrite dans le protocole actuel. Voici un exemple de détection de la fonction de barrière endothéliale dans le modèle de ligature du canal SMG de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le maintien et la régulation de la fonction barrière endothéliale sont essentiels à l’homéostasie vasculaire. Les cellules endothéliales et leurs jonctions intercellulaires jouent un rôle essentiel dans le maintien et le contrôle de l’intégrité vasculaire12. La force de cisaillement du flux sanguin, les facteurs de croissance et les facteurs inflammatoires peuvent provoquer des changements dans la perméabilité vasculaire et, ainsi, participer à l’apparition et au développement …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 et 81974151) et la Fondation des sciences naturelles de Beijing (subvention 7202082).
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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