생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출
Summary
본 프로토콜에서, 턱밑샘(SMG)의 내피 장벽 기능은 이광자 레이저 스캐닝 현미경 하에 생체 내에서 시험 동물 모델의 각 정맥에 상이한 분자 가중 형광 추적자를 주입함으로써 평가되었다.
Abstract
타액은 구강 및 전반적인 건강에 중요한 역할을합니다. 혈관의 손상되지 않은 내피 장벽 기능은 타액 분비를 가능하게하는 반면, 내피 장벽 기능 장애는 많은 타액선 분비 장애와 관련이 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 턱밑샘 (SMG)에서 내피 조밀 접합부 (TJ)의 기능을 평가하기 위한 생체내 초세포 투과성 검출 방법을 기술한다. 먼저, 상이한 분자량 (4 kDa, 40 kDa 또는 70 kDa)을 갖는 형광 표지 된 덱스 트란을 마우스의 각 정맥에 주입 하였다. 그 후, 일방적 인 SMG를 해부하여 2 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 맞춤형 홀더에 고정 한 다음 혈관, acini 및 덕트에 대한 이미지를 캡처했습니다. 이 방법을 사용하여 혈관에서 acini의 기저측으로, 심지어 acinar 상피를 가로질러 덕트로 다양한 크기의 추적자의 실시간 동적 누출을 모니터링하여 생리적 또는 병리생리학적 조건에서 내피 장벽 기능의 변화를 평가했습니다.
Introduction
다양한 타액선은 주로 감염에 대한 첫 번째 방어선 역할을하고 소화를 돕는 타액을 생성하여 구강 및 전반적인 건강에 필수적인 역할을합니다1. 혈액 공급은 일차 타액을 형성하는 물, 전해질 및 분자를 지속적으로 제공하기 때문에 타액선 분비에 중요합니다. 단단한 접합 (TJ) 복합체에 의해 조절되는 내피 장벽 기능은 물, 용질, 단백질 및 순환 혈관에서 타액선 조직으로 이동하는 세포에도 투과성이 높은 모세 혈관의 투과를 엄격하고 섬세하게 제한합니다 2,3. 우리는 이전에 콜린성 자극에 반응하여 내피 TJ의 개방이 타액 분비를 촉진하는 반면, 내피 장벽 기능의 손상은 쇼그렌 증후군4의 턱밑샘(SMG)의 저분비 및 림프구 침윤과 상호 연결되어 있음을 발견했습니다. 이러한 데이터는 내피 장벽 기능의 기여가 다양한 타액선 질환에 대해 충분한주의를 기울일 필요가 있음을 시사합니다.
이광자 레이저 스캐닝 현미경은 생체 내 온전한 조직에서 세포의 역학을 관찰하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술의 장점 중 하나는 표본이 NIR에 의해 여기될 때 근적외선(NIR)이 가시광선 또는 자외선보다 조직 침투가 더 깊고적절한 조건에서 조직에 명백한 빛 손상을 일으키지 않는다는 것입니다5,6. 실제로, 타액선은 매우 균질하고 표면적인 조직이며, 표면 acinar 세포는 샘 표면 7,8에서 약 30μm 떨어져 있습니다. 생체 내 컨포칼 현미경은 살아있는 마우스 타액선에서 세포하 분해능8에서 외분비 분비와 액틴 세포골격을 연구할 수 있는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고 이광자 레이저 스캐닝 현미경은 기존 컨포칼 현미경의 장점이 있을 뿐만 아니라 더 깊은 조직과 이미지를 보다 명확하게 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, paracellular 투과성 추적자로 자주 사용되고 크기가 다른 장점을 갖는 형광 표지 덱스 트란은 TJ 기공9의 크기를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는 마우스 SMG에서 내피 장벽 기능의 현장 평가를 위해 생체 내 실시간 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 기술이 확립되었습니다. 마우스 SMG에서 생체내 혈관 투과성 검출을 위한 각각의 작업 단계는 현재 프로토콜에 기재되어 있다. 다음은 마우스 SMG 덕트 결찰 모델에서 내피 장벽 기능을 검출하는 예입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
내피 장벽 기능의 유지 및 조절은 혈관 항상성에 필수적입니다. 내피 세포와 그 세포 간 접합부는 혈관 완전성을 유지하고 제어하는 데 중요한 역할을합니다12. 혈류의 전단력, 성장 인자 및 염증 인자는 혈관 투과성의 변화를 일으킬 수 있으므로 고혈압, 당뇨병 및자가 면역 질환과 같은 전신 질환의 발생 및 발달에 참여할 수 있습니다13,14,15<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 및 81974151)과 베이징 자연 과학 재단 (보조금 7202082)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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