In vivo Detektion av vaskulär permeabilitet i musens submandibulära körtel
Summary
I detta protokoll utvärderades endotelbarriärfunktionen hos den submandibulära körteln (SMG) genom att injicera olika molekylviktade fluorescerande spårämnen i vinkelvenerna hos testdjurmodeller in vivo under ett tvåfotonlaserscanningsmikroskop.
Abstract
Saliv spelar en viktig roll i oral och allmän hälsa. Den intakta endotelbarriärfunktionen hos blodkärl möjliggör salivsekretion, medan endotelbarriärdysfunktionen är relaterad till många spottkörtelsekretoriska störningar. Detta protokoll beskriver en in vivo paracellulär permeabilitetsdetektionsmetod för att utvärdera funktionen av endoteltäta korsningar (TJs) i mus submandibulära körtlar (SMG). Först injicerades fluorescensmärkt dextrans med olika molekylvikter (4 kDa, 40 kDa eller 70 kDa) i mössens vinkelvener. Därefter dissekerades och fixerades den ensidiga SMG i den anpassade hållaren under ett tvåfotonlaserskanningsmikroskop, och sedan togs bilder för blodkärl, acini och kanaler. Med hjälp av denna metod övervakades det dynamiska läckaget i realtid av spårämnena av olika storlek från blodkärl till acinis basala sidor och till och med över acinarepitelet i kanalerna för att utvärdera förändringen av endotelbarriärfunktionen under fysiologiska eller patofysiologiska förhållanden.
Introduction
Olika spottkörtlar producerar saliv, som främst fungerar som den första försvarslinjen mot infektioner och hjälper matsmältningen och därmed spelar en viktig roll i oral och allmän hälsa1. Blodtillförsel är avgörande för spottkörtelsekretion eftersom det ständigt ger vatten, elektrolyter och molekyler som bildar det primära salivet. Endotelbarriärfunktion, reglerad av det snäva korsningskomplexet (TJ), begränsar strikt och delikat permeationen av kapillärer, som är mycket permeabla för vatten, lösta ämnen, proteiner och till och med celler som rör sig från de cirkulerande blodkärlen till spottkörtelvävnaderna 2,3. Vi har tidigare funnit att öppningen av endoteliala TJs som svar på en kolinerg stimulans underlättar salivsekretion, medan försämringen av endotelbarriärfunktionen är kopplad till hyposekretion och lymfocytisk infiltration i de submandibulära körtlarna (SMG) i Sjögrens syndrom4. Dessa data tyder på att bidraget från endotelbarriärfunktionen måste ägnas tillräcklig uppmärksamhet åt en mängd olika spottkörtelsjukdomar.
Ett laserscanningsmikroskop med två foton är ett kraftfullt verktyg för att observera dynamiken hos celler i intakt vävnad in vivo. En av fördelarna med denna teknik är att nära infrarött ljus (NIR) har djupare vävnadspenetration än synligt eller ultraviolett ljus när prover exciteras av NIR och inte orsakar uppenbara ljusskador på vävnader under lämpliga förhållanden 5,6. Faktum är att spottkörtlarna är en mycket homogen och ytlig vävnad, där ytacinarcellerna bara är cirka 30 μm från körtelytan 7,8. Det har visat sig att intravital konfokalmikroskopi kan studera exokrin sekretion och aktincytoskelett i levande musspottkörtlar vid subcellulär upplösning8. Tvåfotonlaserscanningsmikroskopi har dock inte bara fördelen med konventionell konfokalmikroskopi utan kan också användas för att upptäcka djupare vävnad och bild tydligare. Här kan fluorescensmärkt dextrans, som ofta används som paracellulära permeabilitetsspårare och har fördelen av olika storlekar, användas för att testa storleken på TJ-por9. I den aktuella studien etableras en intravital realtidslaserscanningsmikroskopiteknik i realtid för in situ-utvärdering av endotelbarriärfunktionen i mus-SMG. Varje arbetssteg för in vivo vaskulär permeabilitetsdetektering i mus-SMG beskrivs i det aktuella protokollet. Här är ett exempel på att detektera endotelbarriärfunktionen i musens SMG-kanalligeringsmodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Underhåll och reglering av endotelbarriärfunktionen är avgörande för vaskulär homeostas. Endotelceller och deras intercellulära korsningar spelar en avgörande roll för att upprätthålla och kontrollera vaskulär integritet12. Skjuvkraften i blodflödet, tillväxtfaktorer och inflammatoriska faktorer kan orsaka förändringar i vaskulär permeabilitet och därmed delta i förekomsten och utvecklingen av systemiska sjukdomar som högt blodtryck, diabetes och autoimmuna sjukdomar<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (bidrag 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 och 81974151) och Beijing Natural Science Foundation (bidrag 7202082).
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
Riferimenti
- Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
- Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
- Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
- Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren’s syndrome. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
- Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
- Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
- Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
- Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
- Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
- Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470 (2020).
