Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso

Amy Flor; Joanna Pagacz; DeShawn Thompson; Stephen Kron

doi:10.3791/64176

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso

5.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/64176

⸱

13 settembre 2022

Amy Flor¹ , Joanna Pagacz¹ , DeShawn Thompson¹ , Stephen Kron¹

¹Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per la quantificazione fluorescente citometrica a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da farmaci chemioterapici in colture cellulari o in modelli tumorali murini. Le procedure opzionali includono la co-immunocolorazione, la fissazione del campione per facilitare l'analisi di grandi lotti o punti temporali e l'arricchimento di cellule senescenti vitali mediante selezione citometrica a flusso.

Abstract

La senescenza cellulare è uno stato di arresto proliferativo indotto da un danno biologico che normalmente si accumula nel corso degli anni nelle cellule che invecchiano, ma può anche emergere rapidamente nelle cellule tumorali come risposta al danno indotto da vari trattamenti antitumorali. La senescenza delle cellule tumorali è generalmente considerata indesiderabile, poiché le cellule senescenti diventano resistenti alla morte e bloccano la remissione del tumore, esacerbando la malignità del tumore e la resistenza al trattamento. Pertanto, l'identificazione di cellule tumorali senescenti è di continuo interesse per la comunità di ricerca sul cancro. Esistono vari saggi di senescenza, molti basati sull'attività del noto marcatore di senescenza, la beta-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal).

Tipicamente, il saggio SA-β-Gal viene eseguito utilizzando un substrato cromogenico (X-Gal) su cellule fisse, con l'enumerazione lenta e soggettiva delle cellule senescenti "blu" mediante microscopia ottica. Saggi migliorati che utilizzano substrati fluorescenti SA-β-Gal permeanti alle cellule, tra cui C_12-FDG (verde) e DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), hanno permesso l'analisi di cellule viventi e consentito l'uso di piattaforme di analisi fluorescenti ad alto rendimento, compresi i citometri a flusso. C_12-FDG è una sonda ben documentata per SA-β-Gal, ma la sua emissione fluorescente verde si sovrappone all'autofluorescenza cellulare intrinseca (AF) che si verifica durante la senescenza a causa dell'accumulo di aggregati lipofuscinici. Utilizzando la sonda SA-β-Gal DDAOG, l'autofluorescenza cellulare verde può essere utilizzata come parametro secondario per confermare la senescenza, aggiungendo affidabilità al test. I restanti canali di fluorescenza possono essere utilizzati per la colorazione della vitalità cellulare o per l'immunomarcatura fluorescente opzionale.

Utilizzando la citometria a flusso, dimostriamo l'uso di DDAOG e autofluorescenza lipofuscina come saggio a doppio parametro per l'identificazione di cellule tumorali senescenti. Viene eseguita la quantificazione della percentuale di cellule senescenti vitali. Se lo si desidera, può essere inclusa una fase di immunomarcatura opzionale per valutare gli antigeni di superficie cellulare di interesse. Le cellule senescenti identificate possono anche essere selezionate citometricamente a flusso e raccolte per l'analisi a valle. Le cellule senescenti raccolte possono essere immediatamente lisate (ad esempio, per saggi immunologici o analisi omiche) o ulteriormente coltivate.

Introduzione

Le cellule senescenti normalmente si accumulano negli organismi nel corso degli anni durante il normale invecchiamento biologico, ma possono anche svilupparsi rapidamente nelle cellule tumorali come risposta ai danni indotti da vari trattamenti antitumorali, tra cui radiazioni e chemioterapia. Sebbene non siano più proliferanti, le cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia (TIS) possono contribuire alla resistenza al trattamento e guidare la recidiva ^1,2,3. I fattori secreti dalle cellule TIS possono esacerbare la malignità tumorale promuovendo l'evasione immunitaria ....