Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso

Summary

Viene presentato un protocollo per la quantificazione fluorescente citometrica a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da farmaci chemioterapici in colture cellulari o in modelli tumorali murini. Le procedure opzionali includono la co-immunocolorazione, la fissazione del campione per facilitare l’analisi di grandi lotti o punti temporali e l’arricchimento di cellule senescenti vitali mediante selezione citometrica a flusso.

Abstract

La senescenza cellulare è uno stato di arresto proliferativo indotto da un danno biologico che normalmente si accumula nel corso degli anni nelle cellule che invecchiano, ma può anche emergere rapidamente nelle cellule tumorali come risposta al danno indotto da vari trattamenti antitumorali. La senescenza delle cellule tumorali è generalmente considerata indesiderabile, poiché le cellule senescenti diventano resistenti alla morte e bloccano la remissione del tumore, esacerbando la malignità del tumore e la resistenza al trattamento. Pertanto, l’identificazione di cellule tumorali senescenti è di continuo interesse per la comunità di ricerca sul cancro. Esistono vari saggi di senescenza, molti basati sull’attività del noto marcatore di senescenza, la beta-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal).

Tipicamente, il saggio SA-β-Gal viene eseguito utilizzando un substrato cromogenico (X-Gal) su cellule fisse, con l’enumerazione lenta e soggettiva delle cellule senescenti “blu” mediante microscopia ottica. Saggi migliorati che utilizzano substrati fluorescenti SA-β-Gal permeanti alle cellule, tra cui C_12-FDG (verde) e DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), hanno permesso l’analisi di cellule viventi e consentito l’uso di piattaforme di analisi fluorescenti ad alto rendimento, compresi i citometri a flusso. C_12-FDG è una sonda ben documentata per SA-β-Gal, ma la sua emissione fluorescente verde si sovrappone all’autofluorescenza cellulare intrinseca (AF) che si verifica durante la senescenza a causa dell’accumulo di aggregati lipofuscinici. Utilizzando la sonda SA-β-Gal DDAOG, l’autofluorescenza cellulare verde può essere utilizzata come parametro secondario per confermare la senescenza, aggiungendo affidabilità al test. I restanti canali di fluorescenza possono essere utilizzati per la colorazione della vitalità cellulare o per l’immunomarcatura fluorescente opzionale.

Utilizzando la citometria a flusso, dimostriamo l’uso di DDAOG e autofluorescenza lipofuscina come saggio a doppio parametro per l’identificazione di cellule tumorali senescenti. Viene eseguita la quantificazione della percentuale di cellule senescenti vitali. Se lo si desidera, può essere inclusa una fase di immunomarcatura opzionale per valutare gli antigeni di superficie cellulare di interesse. Le cellule senescenti identificate possono anche essere selezionate citometricamente a flusso e raccolte per l’analisi a valle. Le cellule senescenti raccolte possono essere immediatamente lisate (ad esempio, per saggi immunologici o analisi omiche) o ulteriormente coltivate.

Introduction

Le cellule senescenti normalmente si accumulano negli organismi nel corso degli anni durante il normale invecchiamento biologico, ma possono anche svilupparsi rapidamente nelle cellule tumorali come risposta ai danni indotti da vari trattamenti antitumorali, tra cui radiazioni e chemioterapia. Sebbene non siano più proliferanti, le cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia (TIS) possono contribuire alla resistenza al trattamento e guidare la recidiva ^1,2,3. I fattori secreti dalle cellule TIS possono esacerbare la malignità tumorale promuovendo l’evasione immunitaria o le metastasi ^4,5. Le cellule TIS sviluppano fenotipi complessi e specifici del contesto, profili metabolici alterati e risposte immunitarie uniche ^6,7,8. Pertanto, l’identificazione e la caratterizzazione delle cellule tumorali TIS indotte da vari approcci terapeutici del cancro è un argomento di continuo interesse per la comunità di ricerca sul cancro.

Per rilevare le cellule tumorali TIS, i saggi di senescenza convenzionali sono ampiamente utilizzati, principalmente basati sulla rilevazione di una maggiore attività dell’enzima marcatore di senescenza, la beta-galattosidasi lisosomiale GLB1⁹. Il rilevamento a un pH lisosomiale quasi neutro (piuttosto che acido) consente il rilevamento specifico della beta-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal)¹⁰. Un saggio standard SA-β-Gal che è stato utilizzato per diversi decenni utilizza X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside), un substrato cromogenico blu della beta-galattosidasi, per rilevare SA-β-Gal in cellule fisse mediante microscopia ottica¹¹. Il test X-Gal consente la conferma visiva qualitativa di TIS utilizzando reagenti comunemente disponibili e apparecchiature di laboratorio. Un microscopio a luce trasmessa di base è l’unica strumentazione necessaria per valutare la presenza del cromogeno blu. Tuttavia, la procedura di colorazione X-Gal può mancare di sensibilità, a volte richiedendo più di 24 ore per lo sviluppo del colore. La colorazione è seguita da un punteggio soggettivo a basso rendimento delle singole cellule senescenti basato sul conteggio delle cellule che mostrano un certo livello di intensità del cromogeno blu al microscopio ottico. Poiché X-Gal è impermeabile alle cellule, questo test richiede celle fissate con solvente, che non possono essere recuperate per l’analisi a valle. Quando si lavora con campioni limitati di animali o pazienti, questo può essere un grosso svantaggio.

Saggi migliorati di SA-β-Gal utilizzando substrati enzimatici fluorescenti permeanti alle cellule, tra cui C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside, verde) e DDAOG (9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-one-7-yl) β-D-Galactopyranoside, far-red) sono stati precedentemente pubblicati in letteratura^12,13,14,15. La struttura chimica della sonda e le caratteristiche ottiche del DDAOG sono mostrate nella figura supplementare S1. Queste sonde cellulari consentono l’analisi di cellule viventi (piuttosto che fisse) e le sonde fluorescenti piuttosto che cromogeniche facilitano l’uso di piattaforme di analisi fluorescenti rapide ad alto rendimento, compresi strumenti di screening ad alto contenuto e citometri a flusso. I citometri a flusso di selezione consentono il recupero di popolazioni arricchite di cellule senescenti viventi da colture cellulari o tumori per l’analisi a valle (ad esempio, western blotting, ELISA o ‘omics). L’analisi della fluorescenza fornisce anche un segnale quantitativo, consentendo una determinazione più accurata della percentuale di cellule senescenti all’interno di un determinato campione. Ulteriori sonde fluorescenti, tra cui sonde di vitalità e anticorpi marcati con fluorofori, possono essere facilmente aggiunte per l’analisi multiplex di bersagli oltre SA-β-Gal.

Simile a DDAOG, C_12-FDG è una sonda fluorescente per SA-β-Gal, ma la sua emissione fluorescente verde si sovrappone alla FA cellulare intrinseca, che si verifica durante la senescenza a causa dell’accumulo di aggregati di lipofuscina nelle cellule¹⁶. Utilizzando la sonda DDAOG rosso, la fibrillazione atriale cellulare verde può essere utilizzata come parametro secondario per confermare la senescenza¹⁷. Ciò migliora l’affidabilità del test utilizzando un secondo marcatore in aggiunta a SA-β-Gal, che spesso può essere inaffidabile come singolo marcatore per la senescenza¹⁸. Poiché la rilevazione della fibrillazione atriale endogena nelle cellule senescenti è un approccio label-free, è un modo rapido e semplice per espandere la specificità del nostro test basato su DDAOG.

In questo protocollo, dimostriamo l’uso di DDAOG e AF come test di citometria a flusso rapido e a doppio parametro per l’identificazione di cellule tumorali TIS vitali da colture in vitro o isolate da tumori trattati con farmaci stabiliti nei topi (Figura 1). Il protocollo utilizza fluorofori compatibili con un’ampia gamma di analizzatori e selezionatori di citometria a flusso commerciali standard (Tabella 1). È abilitata la quantificazione della percentuale di cellule senescenti vitali utilizzando l’analisi citometrica a flusso standard. Se lo si desidera, può essere eseguita una fase di immunomarcatura opzionale per valutare gli antigeni della superficie cellulare di interesse in concomitanza con la senescenza. Le cellule senescenti identificate possono anche essere arricchite utilizzando la metodologia standard di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale. Uno schema che riassume i punti chiave del test DDAOG. (A) Un farmaco che induce TIS viene aggiunto a cellule coltivate di mammiferi o somministrato a topi portatori di tumore. Il tempo è quindi concesso per l’insorgenza della TIS: per le cellule, 4 giorni dopo il trattamento; per i topi, 22 giorni totali, con tre trattamenti ogni 5 giorni più 7 giorni di recupero. Le cellule vengono raccolte o i tumori vengono dissociati in sospensione. (B) I campioni sono trattati con Baf per regolare il pH lisosomiale per la rilevazione di SA-β-Gal per 30 minuti; quindi, la sonda DDAOG viene aggiunta per 60 minuti per rilevare SA-β-Gal. I campioni vengono lavati 2 volte in PBS e viene aggiunta brevemente una macchia di vitalità (15 min). Opzionalmente, i campioni possono essere colorati con anticorpi fluorescenti in canali di fluorescenza aperti e/o fissati per analisi successive. (C) I campioni vengono analizzati utilizzando un citometro a flusso standard. Le cellule vitali sono visualizzate in grafici a punti che mostrano DDAOG rosso (che indica SA-β-Gal) rispetto all’autofluorescenza verde (lipofuscina). Un gate per determinare la percentuale di cellule TIS viene stabilito sulla base di campioni di controllo non trattati (non mostrati). Se viene utilizzato un citometro di selezione (FACS), le cellule TIS possono essere raccolte e rimesse in coltura per ulteriori test in vitro o lisate ed elaborate per saggi di biologia molecolare. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; TIS = senescenza indotta dalla terapia; FL-Ab = anticorpo coniugato con fluorofori; Baf = Bafilomicina A1; SA-β-Gal = beta-galattosidasi associata alla senescenza; PBS = soluzione salina tamponata fosfato; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Fluoroforo	Rileva	Ex/Em (nm)	Laser citometrico (nm)	Rilevatore citometrico / filtro passa banda (nm)
DDAOG	SA-β-Gal	645/6601	640	670 / 30
AF	Lipofuscina	< 600	488	525 / 50
CV450	Vitalità	408/450	405	450 / 50
PE	Marcatore anticorpo/superficie	565/578	561	582 / 15

Tabella 1: Specifiche ottiche dei fluorofori e dei citometri. Le specifiche del citometro utilizzate in questo protocollo sono elencate per uno strumento con un totale di 4 laser e 15 rilevatori di emissioni. DDAOG rilevato a 645/660 nm è la forma della sonda scissa da SA-β-Gal¹. DDAOG non scisso può presentare fluorescenza di basso livello a 460/610 nm, ma viene rimosso mediante fasi di lavaggio nel protocollo. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; AF = autofluorescenza; PE = ficoeritrina; SA-β-Gal = beta-galattosidasi associata alla senescenza.

Protocol

Tutto il lavoro sugli animali descritto è stato approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’Università di Chicago. 1. Preparazione e stoccaggio delle soluzioni stock NOTA: Se le celle saranno selezionate in flusso, tutte le soluzioni devono essere preparate utilizzando tecniche sterili e filtrate attraverso un dispositivo filtrante da 0,22 μm. Preparare una soluzione madre di DDAO-Galactoside a 5 mg/ml in DMSO. Aliqu…

Representative Results

Sono stati condotti diversi esperimenti per dimostrare la comparabilità di DDAOG con X-Gal e C12-FDG per la rilevazione della senescenza da parte di SA-β-Gal. In primo luogo, X-Gal è stato utilizzato per colorare le cellule di melanoma senescenti B16-F10 indotte da ETO (Figura 2A). Un colore blu intenso si è sviluppato in un sottogruppo di cellule trattate con ETO, mentre altre cellule hanno mostrato una colorazione blu meno intensa. La morfologia è stata ingrandita nella mag…

Discussion

Nell’ultimo decennio circa, la citometria a flusso è diventata una piattaforma di analisi più comune nella ricerca sul cancro a causa della popolarità emergente dell’immunologia tumorale, dello sviluppo di citometri a flusso a basso costo e del miglioramento delle strutture di strumentazione condivise presso le istituzioni accademiche. I saggi multicolore sono ora standard, poiché la maggior parte degli strumenti più recenti sono dotati di array ottici viola, blu-verde e da rosso a rosso lontano. Pertanto, questo pr…

Materials

Bafilomycin A1	Research Products International	B40500
Bleomycin sulfate	Cayman	13877
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate	Biolegend	137803	Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma	American Type Culture Collection	CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma	American Type Culture Collection	CRL-6475
Cell scraper	Corning	3008
Cell strainers, 100 µm	Falcon	352360
DDAO-Galactoside	Life Technologies	D6488
DMEM medium 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNAse I	Sigma	DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
Etoposide	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc receptor blocking reagent	Biolegend	101320	Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer)	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter)	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin/Streptomycin 100x	Life Technologies	15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x	Life Technologies	11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo"	TreeStar	n/a	Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114