Studie av funksjonene og aktivitetene til Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 ved bruk av Western Blotting

Summary

Denne protokollen fremhever anvendelsen av vestlig blottingteknikk for å studere funksjonene og aktivitetene til neuronal K-Cl co-transporter KCC2. Protokollen beskriver undersøkelsen av KCC2 fosforylering på kinase reguleringssteder Thr906/1007 via western blotting. Også flere metoder for å bekrefte KCC2-aktivitet er kort fremhevet i denne teksten.

Abstract

Kaliumklorid-kotransportører 2 (KCC2) er medlem av løsemiddelbærerfamilien 12 (SLC12) av kationklorid-kotransportører (CCC), som utelukkende finnes i nevronet og er avgjørende for riktig funksjon av ^{Cl-homeostase} og følgelig funksjonell GABAergisk inhibering. Svikt i riktig regulering av KCC2 er skadelig og har vært assosiert med forekomsten av flere nevrologiske sykdommer, inkludert epilepsi. Det har vært betydelig fremgang med hensyn til å forstå mekanismene som er involvert i reguleringen av KCC2, akkreditert til utvikling av teknikker som gjør det mulig for forskere å studere dets funksjoner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering av kinasereguleringssteder fosforylering) eller indirekte (observasjon og overvåking av GABA-aktivitet) undersøkelser. Her fremhever protokollen hvordan man undersøker KCC2-fosforylering på kinasereguleringssteder – Thr906 og Thr1007 – ved hjelp av vestlig blottingteknikk. Det finnes andre klassiske metoder som brukes til å måle KCC2-aktivitet direkte, for eksempel rubidiumion og thalliumionopptaksanalyse. Ytterligere teknikker som patch-klemme-elektrofysiologi brukes til å måle GABA-aktivitet; derfor indirekte reflekterer aktivert og/eller inaktivert KCC2 som informert av vurderingen av intracellulær kloridionhomeostase. Noen av disse tilleggsteknikkene vil bli kort omtalt i dette manuskriptet.

Introduction

Kaliumklorid-kotransportører 2 (KCC2) er medlem av løsemiddelbærerfamilien 12 (SLC12) av kationklorid-kotransportører (CCC), som utelukkende finnes i nevronet og er avgjørende for riktig funksjon av ^{Cl-homeostase} og følgelig funksjonell GABAergisk inhibering 1,2,3,4. Opprettholdelsen av lav intranevronal Cl-konsentrasjon ([Cl-]i) ved 4-6 mM av KCC2 muliggjør ^{γ-aminosmørsyre} (GABA)/glycin hyperpolarisering og synaptisk hemming i hjernen og ryggmargen⁵. Svikt i riktig regulering av KCC2 har vært assosiert med forekomsten av flere nevrologiske sykdommer, inkludert epilepsi⁴. Videre har redusert KCC2-mediert ^{Cl-ekstrudering} og nedsatt hyperpolariserende GABA_A og / eller glycinreseptormediert strøm vært involvert i epilepsi, nevropatisk smerte og spastisitet ^6,7. Neuronal KCC2 er negativt modulert via fosforylering av viktige regulatoriske rester innenfor sitt C-terminale intracellulære domene av med-no-lysin (WNK)-STE20/SPS1-relatert prolin/alaninrikt (SPAK)/Oksidativt stressresponsivt (OSR) kinasesignalkompleks¹, som letter opprettholdelsen av depolarisert GABA-aktivitet i umodne nevroner ^2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1 fosforylerer treoninrester 906 og 1007 (Thr906/Thr1007) og nedregulerer deretter mRNA-genuttrykket til KCC2, noe som fører til en påfølgende forverring av dens fysiologiske funksjon ^8,10. Enda viktigere er det imidlertid allerede et faktum at WNK-SPAK/OSR1-kinasekomplekset er kjent for å fosforylere og hemme KCC2-uttrykk 1,2,4,11,12, og at inhiberingen av kinasekompleksets signalveier til fosforylat Thr906/Thr1007 har vært knyttet til det økte uttrykket av KCC2 mRNA-genet^13,14,15 . Det er viktig å merke seg at reguleringen av nevronal KCC2 og Na+-K⁺-2Cl^– kotransportører 1 (NKCC1) ekspresjon via proteinfosforylering virker samtidig og i omvendte mønstre 1,4,16.

Det har vært konsekvent og betydelig fremgang med hensyn til forståelsen av mekanismer involvert i reguleringen av KCC2, akkreditert til utvikling av teknikker som gjør det mulig for forskere å studere sine funksjoner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering av kinasereguleringssteder fosforylering) eller indirekte (observasjon og overvåking av GABA-aktivitet) undersøkelser. Protokollen som presenteres her fremhever anvendelsen av vestlige blottingteknikker for å studere funksjonene og aktivitetene til neuronal K ⁺ -Cl^– co-transporter KCC2 ved å undersøke fosforyleringen av kotransportøren på kinasereguleringssteder Thr906/1007.

Western blot er en metode som brukes til å oppdage spesifikke proteiner av interesse fra en prøve av vev eller celle. Denne metoden separerer først proteinene etter størrelse gjennom elektroforese. Proteinene overføres deretter elektroforetisk til en solid støtte (vanligvis en membran) før målproteinet merkes ved hjelp av et spesifikt antistoff. Antistoffene er konjugert til forskjellige koder eller fluoroforkonjugerte antistoffer som oppdages ved hjelp av enten kolorimetriske, kjemiluminescens- eller fluorescensmetoder. Dette gjør det mulig å oppdage et bestemt målprotein fra en blanding av proteiner. Denne teknikken har blitt brukt til å karakterisere fosfospesifikke steder av KCC¹ og har blitt brukt til å identifisere kinasehemmere som hemmer KCC3 Thr991 / Thr1048 fosforylering¹⁷. Ved å følge denne protokollen kan man spesifikt oppdage total og fosforylert KCC2 fra celle/vevslysater. I prinsippet er påvisning av proteinkonjugerte antistoffer ved hjelp av denne teknikken svært instrumentell, da det bidrar til å forbedre forståelsen av samarbeidsaktiviteter på fosfo-stedene til KCC2, som kaster lys over de molekylære mekanismene som er involvert i deres fysiologiske forskrifter. Den kvantitative analysen av det totale proteinuttrykket er representativt for funksjonen og aktiviteten til KCC2. Det finnes andre klassiske metoder som brukes til å måle KCC2-aktivitet direkte, for eksempel rubidiumion og thalliumionopptaksanalyse. Ytterligere teknikker som patch-klemme-elektrofysiologi brukes til å måle GABA-aktivitet; derfor indirekte reflekterer aktivert og/eller inaktivert KCC2 som informert av vurderingen av intracellulær kloridionhomeostase.

Protocol

MERK: Protokollen beskriver den vestlige blottingmetoden for å oppdage spesifikke proteiner av interesse. 1. Cellekultur og transfeksjon Varm alle reagensene i perlebadet (37 °C) før cellekulturprosedyren. Forbered kulturmedium, Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% hver av 2mM L-glutamin, 100x ikke-essensiell aminosyre, 100 mM natriumpyruvat og 100 enheter / ml penicillin-streptomycin. Tin stabilt transfisert …

Representative Results

Her undersøkte det representative resultatet presentert i figur 1 virkningen av staurosporin og NEM på WNK-SPAK/OSR1-mediert fosforylering av KCC2 og NKCC1 i HEK293-cellelinjer som stabilt uttrykker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 ved hjelp av western blotting-teknikken. Omfattende detaljer om de representative resultatene er omtalt i Zhang et al.15. I likhet med NEM er staurosporin en bred kinasehemmer som kan øke KCC2-transportakt…

Discussion

Mange metoder har blitt brukt til å måle aktivitetene til SLC12 av CCC som uttrykkes i nevronene, inkludert KCC2. Mange av disse teknikkene har vist seg å øke vitenskapelig kunnskap om analysen av den funksjonelle relevansen til disse transportørene og deres strukturfunksjonsmønstre i forskjellige sykdomsrelaterte mutasjoner. Kritisk er det fordeler og forbehold ved de ulike metodene²¹. Protokollen forklart ovenfor skisserte imidlertid hvordan man vurderer KCC2-fosforylering på kinaseregule…

Materials

40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions