Detta protokoll belyser tillämpningen av western blotting-teknik för att studera funktioner och aktiviteter hos neuronal K-Cl-co-transporter KCC2. Protokollet beskriver undersökningen av KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen Thr906/1007 via western blotting. Dessutom markeras ytterligare metoder för att bekräfta KCC2-aktivitet kort i den här texten.
Kaliumkloridkotransporterer 2 (KCC2) är en medlem av den lösta bärarfamiljen 12 (SLC12) av katjonklorid-cotransporters (CCC), som uteslutande finns i neuronen och är avgörande för att Cl-homeostas ska fungera korrekt och följaktligen funktionell GABAergisk hämning. Misslyckande med korrekt reglering av KCC2 är skadligt och har associerats med förekomsten av flera neurologiska sjukdomar, inklusive epilepsi. Det har gjorts betydande framsteg när det gäller att förstå de mekanismer som är involverade i regleringen av KCC2, ackrediterade för utveckling av tekniker som gör det möjligt för forskare att studera dess funktioner och aktiviteter. antingen via direkta (bedömning av kinasreglerande platser fosforylering) eller indirekta (observera och övervaka GABA-aktivitet) undersökningar. Här belyser protokollet hur man undersöker KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen – Thr906 och Thr1007 – med hjälp av western blotting-teknik. Det finns andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet, såsom rubidiumjon och talliumjonupptagsanalys. Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas. Några av dessa ytterligare tekniker kommer att diskuteras kort i detta manuskript.
Kaliumkloridkotransporterer 2 (KCC2) är en medlem av den lösta bärarfamiljen 12 (SLC12) av katjonklorid-cotransporters (CCC), som uteslutande finns i neuronen och är avgörande för att Cl-homeostas ska fungera korrekt och följaktligen funktionell GABAergisk hämning 1,2,3,4. Upprätthållandet av låg intraneuronal Cl- koncentration ([Cl-]i) vid 4-6 mM av KCC2 underlättar γ-aminosmörsyra (GABA)/glycinhyperpolarisering och synaptisk hämning i hjärnan och ryggmärgen5. Misslyckande i korrekt reglering av KCC2 har associerats med förekomsten av flera neurologiska sjukdomar, inklusive epilepsi4. Dessutom har minskad KCC2-medierad Cl−-extrudering och nedsatt hyperpolariserande GABAA– och/eller glycinreceptormedierade strömmar varit inblandade i epilepsi, neuropatisk smärta och spasticitet 6,7. Neuronal KCC2 moduleras negativt via fosforylering av viktiga regulatoriska rester inom dess C-terminala intracellulära domän av med-ingen-lysin (WNK) -STE20 / SPS1-relaterad prolin / alaninrik (SPAK) / Oxidativ stressresponsiv (OSR) kinassignalkomplex1, vilket underlättar upprätthållandet av depolariserad GABA-aktivitet i omogna neuroner 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1-fosforylerar treoninrester 906 och 1007 (Thr906/Thr1007) och nedreglerar därefter mRNA-genuttrycket av KCC2, vilket leder till en därav följande försämring av dess fysiologiska funktion 8,10. Ännu viktigare är dock att det redan är ett faktum att WNK-SPAK / OSR1-kinaskomplexet är känt för att fosforylera och hämma KCC2-uttryck 1,2,4,11,12, och att hämningen av kinaskomplexets signalvägar till fosforylat Thr906 / Thr1007 har kopplats till det ökade uttrycket av KCC2 mRNA-genen13,14,15 . Det är viktigt att notera att regleringen av neuronala KCC2- och Na+-K+-2Cl– cotransporters 1 (NKCC1) uttryck via proteinfosforylering fungerar samtidigt och i omvända mönster 1,4,16.
Det har gjorts konsekventa och betydande framsteg när det gäller förståelsen av mekanismer som är involverade i regleringen av KCC2, ackrediterade för utveckling av tekniker som gör det möjligt för forskare att studera dess funktioner och aktiviteter. antingen via direkta (bedömning av kinasreglerande platser fosforylering) eller indirekta (observera och övervaka GABA-aktivitet) undersökningar. Protokollet som presenteras här belyser tillämpningen av västerländska blottningstekniker för att studera funktionerna och aktiviteterna hos neuronal K +-Cl– co-transporter KCC2 genom att undersöka fosforyleringen av cotransporter vid kinasregleringsställen Thr906/1007.
Western blot är en metod som används för att detektera specifika proteiner av intresse från ett prov av vävnad eller cell. Denna metod separerar först proteinerna efter storlek genom elektrofores. Proteinerna överförs sedan elektroforetiskt till ett fast stöd (vanligtvis ett membran) innan målproteinet markeras med hjälp av en specifik antikropp. Antikropparna konjugeras till olika taggar eller fluoroforkonjugerade antikroppar som detekteras med antingen kolorimetriska, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Detta gör det möjligt att detektera ett specifikt målprotein från en blandning av proteiner. Denna teknik har använts för att karakterisera fosfospecifika ställen för KCCs1 och har använts för att identifiera kinashämmare som hämmar KCC3 Thr991/Thr1048 fosforylering17. Genom att följa detta protokoll kan man specifikt detektera total och fosforylerad KCC2 från cell/ vävnadslysater. I princip är detektionen av proteinkonjugerade antikroppar med denna teknik mycket instrumentell eftersom den bidrar till att förbättra förståelsen för samarbetsaktiviteter vid fosfo-platserna i KCC2, vilket belyser de molekylära mekanismerna som är involverade i deras fysiologiska regler. Den kvantitativa analysen av det totala proteinuttrycket är representativ för KCC2: s funktion och aktivitet. Det finns andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet, såsom rubidiumjon och talliumjonupptagsanalys. Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas.
Många metoder har använts för att mäta aktiviteterna hos SLC12 av CCC som uttrycks i neuronerna, inklusive KCC2. Många av dessa tekniker har visat sig öka den vetenskapliga kunskapen om analysen av dessa transportörers funktionella relevans och deras struktur-funktionsmönster i olika sjukdomsrelaterade mutationer. Kritiskt finns det fördelar och förbehåll för de olika metoderna21. Protokollet som förklaras ovan beskrev dock hur man bedömer KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställ…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av The Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) och ett Commonwealth Ph.D. Scholarship.
40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
Gel Blotting – Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |