Oprettelse af et knæled-på-en-chip til modellering af ledsygdomme og test af lægemidler
Summary
Vi leverer detaljerede metoder til generering af fire typer væv fra humane mesenkymale stamceller, som bruges til at rekapitulere brusk, knogle, fedtpude og synovium i det menneskelige knæled. Disse fire væv er integreret i en tilpasset bioreaktor og forbundet via mikrofluidik, hvilket genererer et knæled-på-en-chip.
Abstract
Den høje forekomst af invaliderende ledsygdomme som slidgigt (OA) udgør en høj socioøkonomisk byrde. I øjeblikket er de tilgængelige lægemidler, der er målrettet mod ledlidelser, for det meste palliative. Det uopfyldte behov for effektive sygdomsmodificerende OA-lægemidler (DMOAD’er) skyldes primært manglen på passende modeller til undersøgelse af sygdomsmekanismerne og testning af potentielle DMOAD’er. Heri beskriver vi etableringen af et miniature synovialt led-efterlignende mikrofysiologisk system (miniJoint) bestående af fedt-, fibrøse og osteokondrale vævskomponenter afledt af humane mesenkymale stamceller (MSC’er). For at opnå de tredimensionelle (3D) mikrovæv blev MSC’er indkapslet i fototværbindende methacryleret gelatine før eller efter differentiering. De cellebelastede vævskonstruktioner blev derefter integreret i en 3D-printet bioreaktor, der dannede miniJoint. Separate strømme af osteogene, fibrogene og adipogene medier blev introduceret for at opretholde de respektive vævsfænotyper. En almindeligt delt strøm blev perfuseret gennem brusk, synoviale og fedtvæv for at muliggøre vævskrydstale. Dette strømningsmønster tillader induktion af forstyrrelser i en eller flere af vævskomponenterne til mekanistiske undersøgelser. Desuden kan potentielle DMOAD’er testes via enten “systemisk administration” gennem alle mediestrømme eller “intraartikulær administration” ved kun at tilføje lægemidlerne til det delte “synovialvæske”-simulerende flow. Således kan miniJoint fungere som en alsidig in vitro-platform til effektivt at studere sygdomsmekanismer og teste lægemidler i personlig medicin.
Introduction
Fælles sygdomme som slidgigt (OA) er meget udbredt og invaliderende og repræsenterer en førende årsag til handicap på verdensplan1. Det anslås, at OA alene i USA påvirker 27 millioner patienter og forekommer hos 12,1% af voksne i alderen 60 år og derover2. Desværre er de fleste lægemidler, der i øjeblikket bruges til at håndtere ledsygdomme, palliative, og der findes ingen effektive sygdomsmodificerende OA-lægemidler (DMOAD’er)3. Dette uopfyldte medicinske behov skyldes primært, at der ikke findes en effektiv model til undersøgelse af sygdomsmekanismerne og udvikling af potentielle DMOAD’er. Den konventionelle todimensionelle (2D) cellekultur afspejler ikke ledvævets 3D-natur, og kulturen af vævseksplanter hindres ofte af betydelig celledød og replikerer normalt ikke de dynamiske vævsforbindelser4. Derudover reducerer genetiske og anatomiske forskelle signifikant den fysiologiske relevans af dyremodeller4.
Organ-on-chips (OoC’er) eller mikrofysiologiske systemer er et lovende forskningsfelt i grænsefladen mellem teknik, biologi og medicin. Disse in vitro-platforme er minimale funktionelle enheder, der replikerer definerede sunde eller patologiske træk ved deres in vivo-modstykker 5. Desuden kan disse miniaturiserede systemer være vært for forskellige celler og matricer og simulere de biofysiske og biokemiske interaktioner mellem forskellige væv. Derfor lover et mikrofysiologisk system, der trofast kan rekapitulere det oprindelige synoviale led, at tilbyde en effektiv platform til modellering af ledsygdomme og udvikling af potentielle DMOAD’er.
Humane mesenkymale stamceller (MSC’er) kan isoleres fra mange væv i hele kroppen og differentieres til osteogene, kondrogene og adipogene slægter6. MSC’er er med succes blevet brugt til at konstruere forskellige væv, herunder knogle-, brusk- og fedtvæv6, hvilket betyder, at de repræsenterer en lovende cellekilde til konstruktion af knæleddets vævskomponenter. Vi har for nylig udviklet et mikrofysiologisk miniaturesystem, der efterligner leddene, kaldet miniJoint, der omfatter MSC-afledt knogle-, brusk-, fibrøst- og fedtvæv7. Især muliggør det nye design vævskrydstale ved mikrofluidisk strømning eller gennemtrængning (figur 1). Heri præsenterer vi protokollerne for fremstilling af chipkomponenterne, konstruktion af vævskomponenterne, kulturen af det manipulerede væv i chippen og indsamling af væv til downstream-analyser.
Figur 1: Skematisk oversigt over miniJoint-chippen, der viser arrangementet af de forskellige vævskomponenter og mediestrømme. OC = osteokondralt væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en protokol til oprettelse af et knæled-på-en-chip-system, hvor knogler, brusk, fedtvæv og synoviumlignende væv dannes fra MSC’er og dyrkes sammen i en tilpasset bioreaktor. Dette multikomponent, humane celleafledte system med plug-and-play-funktioner repræsenterer et nyt værktøj til at studere patogenesen af ledsygdomme og udvikle lægemidler.
I betragtning af at forskellige væv favoriserer specifikke kulturmedier, er det afgørende at tilvejebringe de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev primært støttet af finansiering fra National Institutes of Health (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Derudover takker vi Dr. Paul Manner (University of Washington) for at levere de humane vævsprøver og Dr. Jian Tan for deres hjælp med at isolere MSC’erne og skabe cellepuljen.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
Riferimenti
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biologia. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
