Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis
Summary
Dieser Artikel stellt die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die CRISPR/Cas9-Mutagenese der orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis vor. Detaillierte Schritte, die von diesem standardisierten Protokoll bereitgestellt werden, werden als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für funktionelle Genstudien in B. dorsalis dienen.
Abstract
Die orientalische Fruchtfliege, Bactrocera dorsalis, ist eine hochinvasive und anpassungsfähige Schädlingsart, die Zitrusfrüchte und über 150 andere Obstkulturen weltweit schädigt. Da erwachsene Fruchtfliegen eine große Flugkapazität haben und Weibchen ihre Eier unter die Schalen von Früchten legen, schneiden Insektizide, die direkten Kontakt mit dem Schädling erfordern, auf dem Feld normalerweise schlecht ab. Mit der Entwicklung molekularbiologischer Werkzeuge und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie versuchen viele Wissenschaftler, umweltfreundliche Schädlingsbekämpfungsstrategien zu entwickeln. Dazu gehören RNAi- oder Gen-Editing-basierte Pestizide, die Gene (molekulare Ziele), wie olfaktorische Gene, die am Suchverhalten beteiligt sind, in verschiedenen Insektenschädlingen herunterregulieren oder zum Schweigen bringen. Um diese Strategien für die Bekämpfung orientalischer Fruchtfliegen anzupassen, sind effektive Methoden zur funktionellen Genforschung erforderlich. Gene mit kritischen Funktionen beim Überleben und der Fortpflanzung von B. dorsalis dienen als gute molekulare Ziele für Gen-Knockdown und/oder Silencing. Das CRISPR/Cas9-System ist eine zuverlässige Technik zur Genbearbeitung, insbesondere bei Insekten. Dieser Artikel stellt eine systematische Methode für die CRISPR/Cas9-Mutagenese von B. dorsalis vor, einschließlich des Designs und der Synthese von Guide-RNAs, der Entnahme von Embryonen, der Embryoinjektion, der Insektenaufzucht und des Mutantenscreenings. Diese Protokolle dienen als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für Forscher, die an funktionellen Genstudien in B. dorsalis interessiert sind.
Introduction
Die orientalische Fruchtfliege, Bactrocera dorsalis , ist eine kosmopolitische Insektenschädlingsart, die Schäden an über 150 Arten von Obstkulturen verursacht, darunter Guave, Mango, Eugenia spp., Surinam-Kirsche, Zitrusfrüchte, Mispel und Papaya1. Der Schaden allein in der Provinz Guangdong (China) wird auf über 200 Millionen Yuan geschätzt. Erwachsene Weibchen legen ihre Eier unter die Haut reifender oder gereifter Früchte, was zu Verfall und Zerfall der Frucht führt, was die Fruchtqualität und den Gesamtertrag der Ernte verringert2. Da erwachsene Fruchtfliegen eine große Flugkapazität haben und sich ihre Larven in die Fruchthaut bohren, schneiden Insektizide, die direkten Kontakt mit dem Schädling erfordern, auf dem Feld schlecht ab. Darüber hinaus hat der umfangreiche Einsatz von Insektiziden die Resistenz von B. dorsalis gegen verschiedene landwirtschaftliche Chemikalien erhöht, was die Bekämpfung dieser schädlichen Schädlinge noch schwieriger macht3. Daher ist die Entwicklung effektiver und umweltfreundlicher Schädlingsbekämpfungsstrategien dringend erforderlich.
In jüngster Zeit versuchen Wissenschaftler mit der Entwicklung molekularbiologischer Werkzeuge und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien, umweltfreundliche Schädlingsbekämpfungsstrategien wie RNAi zu entwickeln, die auf die Funktionalität wichtiger Gene (molekulare Ziele) verschiedener Schadinsekten abzielen. Gene, die für das Überleben und die Vermehrung des Schädlings entscheidend sind, können durch funktionelle Genstudien identifiziert werden und dienen weiterhin als potenzielle molekulare Ziele für die Verbesserung spezifischer und umweltfreundlicher Schädlingsbekämpfungsinstrumente4. Um solche Strategien an die Bekämpfung orientalischer Fruchtfliegen anzupassen, sind effektive Methoden zur funktionellen Genforschung erforderlich.
Das CRISPR/Cas-Endonuklease-System (Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-assoziiert) wurde zunächst in Bakterien und Archaeen entdeckt und erwies sich als adaptiver Mechanismus, der an der Erkennung und dem Abbau von intrazellulärer Fremd-DNA beteiligt ist, wie sie durch die Infektion von Bakteriophagen eingeführt wird5. Im Typ-II-CRISPR-System wird die Cas9-Endonuklease von kleinen assoziierten RNAs (crRNA und tracrRNA) geleitet, um die eindringende DNA 6,7,8 zu spalten und ist zu einem der am häufigsten verwendeten Werkzeuge für die Gen-Editierung geworden 9,10,11,12. Da das CRISPR/Cas9-System mehrere Vorteile hat, wie z.B. eine hohe Effizienz der Gen-Silencing und niedrige Kosten, wurde es bereits für die Gen-Editierung bei verschiedenen Insektenarten eingesetzt, darunter Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 und Bombyx mori16. Bei B. dorsalis wurden Gene, die mit Körperfarbe, Flügeldimorphismus und Geschlechtsbestimmung zusammenhängen, erfolgreich mit CRISPR/Cas917,18,19 ausgeschaltet. Die detaillierten Verfahren zur Anwendung von CRISPR/Cas9 bei diesem Insekt sind jedoch noch unvollständig. Darüber hinaus sind einige Schritte, die von Forschern für die Genbearbeitung von B. dorsalis bereitgestellt wurden, ebenfalls vielfältig und bedürfen einer Standardisierung. Zum Beispiel waren die Formen von Cas9 in den veröffentlichten Referenzen17,18,19 unterschiedlich.
Dieser Artikel bietet eine systematische Methode für die Mutagenese von B. dorsalis unter Verwendung des CRISPR / Cas9-Systems, einschließlich des Designs und der Synthese von Guide-RNAs, der Sammlung von Embryonen, der Embryoinjektion, der Insektenaufzucht und des Mutantenscreenings. Dieses Protokoll wird Forschern, die an den funktionellen Genstudien an B. dorsalis interessiert sind, als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen dienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das CRISPR/Cas9-System ist das am weitesten verbreitete Gen-Editing-Tool und hat verschiedene Anwendungen, wie Gen-Threpy30, Pflanzenzüchtung 31 und grundlegende Studien der Genfunktionen32. Dieses System wurde bereits für die Gen-Editierung bei verschiedenen Insektenarten eingesetzt und diente als effektives Werkzeug für funktionelle Genstudien bei Schädlingen. Die Protokolle, die wir hier vorstellen, standardisieren das Verfahren des Designs un…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) und Sonderfonds für wissenschaftlich-technologische Innovation und industrielle Entwicklung des Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02) unterstützt.
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
Riferimenti
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