Il presente protocollo descrive la semina e la colorazione dei mitocondri neuronali in camere microfluidiche. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere consente il trattamento selettivo dei mitocondri negli assoni per analizzare le loro proprietà in risposta alle sfide farmacologiche senza influenzare il compartimento corporeo cellulare.
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Articolo metodologico
Depolarizzazione selettiva assistita da microfluidica dei mitocondri assonali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. La disfunzione mitocondriale è un fenotipo comune in molte malattie neurodegenerative. Data l'architettura elaborata e l'estrema lunghezza di alcuni assoni, non sorprende che i mitocondri negli assoni possano sperimentare ambienti diversi rispetto alle loro controparti del corpo cellulare. È interessante notare che la disfunzione dei mitocondri assonali spesso precede gli effetti sul corpo cellulare. Per modellare la disfunzione mitocondriale assonale in vitro, i dispositivi microfluidici consentono il trattamento dei mitocondri assonali senza influenzare i mitocondri somali. Il gradiente di pressione fluidica in queste camere impedisce la diffusione delle molecole contro il gradiente, consentendo così l'analisi delle proprietà mitocondriali in risposta alle sfide farmacologiche locali all'interno degli assoni. L'attuale protocollo descrive la semina di neuroni ippocampali dissociati in dispositivi microfluidici, la colorazione con un colorante sensibile al potenziale di membrana, il trattamento con una tossina mitocondriale e la successiva analisi microscopica. Questo metodo versatile per studiare la biologia assonale può essere applicato a molte perturbazioni farmacologiche e letture di imaging ed è adatto a diversi sottotipi neuronali.
Introduzione
I mitocondri sono i principali fornitori di ATP (adenosina trifosfato) nei neuroni. Poiché la salute neuronale è intimamente legata alla funzione mitocondriale, non sorprende che la regolazione disfunzionale di questi organelli sia stata associata all'insorgenza di varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson1. Inoltre, l'intossicazione mitocondriale è stata utilizzata con successo per modellare i sintomi parkinsoniani negli animali2. Sia nei modelli animali che nelle malattie umane, la scomparsa dei neuroni inizia alle parti distali3,4,
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo le linee guida e i regolamenti pertinenti del governo dell'Alta Baviera. I neuroni primari sono stati preparati da E16.5 C57BL/6 embrioni di topo wild-type di entrambi i sessi seguendo metodi standard come precedentemente descritto6.
1. Assemblaggio del dispositivo microfluidico
- Rivestire una piastra di coltura tissutale con fondo di vetro a sei pozzetti con una concentrazione finale di 20 μg/ml di poli-D-lisina e 3,4 μg/ml di laminina in PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) (vedere Tabella dei materiali
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Risultati
I neuroni ippocampali primari sono stati coltivati in dispositivi microfluidici per 7-8 giorni prima che i mitocondri fossero colorati con il colorante sensibile alla membrana (TMRE) per 25 minuti in entrambi i canali. Come mostrato nella Figura 2A, questo ha prodotto una colorazione omogenea dei mitocondri su entrambi i lati dei microsolchi, ma era insufficiente per equilibrare la colorazione nel mezzo dei microsolchi. Dopo l'aggiunta di Antimicina A al lato assonale, i mitocondri somali ha.......
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Discussione
Il presente protocollo descrive un metodo per seminare e coltivare neuroni ippocampali dissociati in un dispositivo microfluidico per trattare separatamente i mitocondri assonali. L'utilità di questo approccio con il colorante sensibile alla membrana TMRE e l'inibitore III complesso Antimicina A (come precedentemente dimostrato7) è dimostrata qui, ma questo metodo può essere facilmente adattato ad altri coloranti mitocondriali o sensori geneticamente codificati di funzioni mitocondriali che consen.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (HA 7728/2-1 e EXC2145 Project ID 390857198) e dalla Max Planck Society.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra inferiore in vetro a 6 pozzetti | Cellvis | P06.1.5H-N | Dispositivo in silicone |
| Antimicina A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 microscopio a campo largo | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | microscopio digitale a campo largo completamente integrato |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Disco rotante invertito confocale | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | Con camera incubatrice |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Dispositivi microfluidici | XONA microfluidica | RD450 | |
| Medium neurobasale | Gibco | 21103049 | |
| Poli-D-lisina | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
Riferimenti
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663(2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 3....
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Ristampe e permessi
