Undersökning av mikrobiellt samarbete via avbildande masspektrometrianalys av bakteriekolonier odlade på agar och i vävnad under infektion
Summary
En ny provberedningsmetod demonstreras för analys av agarbaserade, bakteriella makrokolonier via matrisassisterad laserdesorption/joniseringsavbildande masspektrometri.
Abstract
Att förstå de metaboliska konsekvenserna av mikrobiella interaktioner som uppstår under infektion utgör en unik utmaning för området biomedicinsk avbildning. Matrix-assisted laser desorption / jonisering (MALDI) avbildning masspektrometri representerar en etikettfri, in situ avbildningsmodalitet som kan generera rumsliga kartor för en mängd olika metaboliter. Medan tunt snittade vävnadsprover nu rutinmässigt analyseras via denna teknik, är avbildande masspektrometrianalyser av icke-traditionella substrat, såsom bakteriekolonier som vanligtvis odlas på agar i mikrobiologisk forskning, fortfarande utmanande på grund av det höga vatteninnehållet och ojämn topografi hos dessa prover. Detta dokument demonstrerar ett arbetsflöde för provberedning för att möjliggöra avbildning av masspektrometrianalyser av dessa provtyper. Denna process exemplifieras med hjälp av bakteriella samodlingsmakrokolonier av två gastrointestinala patogener: Clostridioides difficile och Enterococcus faecalis. Studier av mikrobiella interaktioner i denna väldefinierade agarmiljö visar sig också komplettera vävnadsstudier som syftar till att förstå mikrobiellt metaboliskt samarbete mellan dessa två patogena organismer i musmodeller av infektion. Avbildning av masspektrometrianalyser av aminosyrametaboliterna arginin och ornitin presenteras som representativa data. Denna metod är allmänt tillämplig på andra analyter, mikrobiella patogener eller sjukdomar och vävnadstyper där ett rumsligt mått på cellulär eller vävnadsbiokemi önskas.
Introduction
Den mänskliga mikrobiomen är ett mycket dynamiskt ekosystem som involverar molekylära interaktioner mellan bakterier, virus, arkéer och andra mikrobiella eukaryoter. Medan mikrobiella relationer har studerats intensivt de senaste åren, återstår mycket att förstå om mikrobiella processer på kemisk nivå 1,2. Detta beror delvis på att det inte finns verktyg som kan mäta komplexa mikrobiella miljöer exakt. Framsteg inom området avbildande masspektrometri (IMS) under det senaste decenniet har möjliggjort in situ och etikettfri rumslig kartläggning av många metaboliter, lipider och proteiner i biologiska substrat 3,4. Matrix-assisted laser desorption / jonisering (MALDI) har framkommit som den vanligaste joniseringstekniken som används vid avbildning av masspektrometri, vilket innebär användning av en UV-laser för att ablatera material från ytan av en tunn vävnadssektion för mätning med masspektrometri4. Denna process underlättas genom applicering av en kemisk matris som appliceras homogent på provets yta, vilket gör det möjligt att göra sekventiella mätningar i ett rastermönster över provytan. Värmekartor över analytjonintensiteter genereras sedan efter datainsamling. De senaste framstegen inom joniseringskällor och provtagningstekniker har möjliggjort analys av icke-traditionella substrat såsom bakteriell5 ochdäggdjur 6,7,8 cellulära prover odlade på näringsagar. Den molekylära rumsliga informationen från IMS kan ge unik inblick i den biokemiska kommunikationen av mikrob-mikrob och värd-mikrobinteraktioner under infektion 9,10,11,12,13,14.
Vid Clostridioides difficile-infektion (CDI) utsätts C. difficile för en snabbt föränderlig mikrobiell miljö i mag-tarmkanalen, där polymikrobiella interaktioner sannolikt kommer att påverka infektionsresultaten15,16. Förvånansvärt lite är känt om de molekylära mekanismerna för interaktioner mellan C. difficile och bosatt mikrobiota under infektion. Till exempel är enterokocker en klass av opportunistiska kommensala patogener i tarmmikrobiomet och har associerats med ökad mottaglighet för och svårighetsgrad av CDI17,18,19,20. Men lite är känt om de molekylära mekanismerna för interaktionerna mellan dessa patogener. För att visualisera småmolekylär kommunikation mellan dessa medlemmar av tarmmikrobiomet odlades bakteriella makrokolonier här på agar för att simulera mikrob-mikrobinteraktioner och bakteriell biofilmbildning i en kontrollerad miljö. Att erhålla representativa metaboliska fördelningar vid MALDI-avbildande masspektrometrianalys av bakteriekulturprover är dock utmanande på grund av det höga vatteninnehållet och ojämn yttopografi hos dessa prover. Detta orsakas till stor del av agarns mycket hydrofila natur och den ojämna agarytans respons under fuktavlägsnande.
Den höga vattenhalten i agar kan också göra det utmanande att uppnå homogen MALDI-matrisbeläggning och kan störa efterföljande MALDI-analys utförd i vakuum21. Till exempel arbetar många MALDI-källor vid tryck på 0,1-10 Torr, vilket är ett tillräckligt vakuum för att avlägsna fukt från agar och kan orsaka deformation av provet. Dessa morfologiska förändringar i agar inducerade av vakuummiljön orsakar bubbling och sprickbildning i det torkade agarmaterialet. Dessa artefakter minskar agarens vidhäftning till objektglaset och kan orsaka demontering eller flagning av provet i instrumentets vakuumsystem. Tjockleken på agarproverna kan vara upp till 5 mm från objektglaset, vilket kan skapa otillräckligt spelrum från jonoptik inuti instrumentet, vilket orsakar kontaminering och/eller skador på instrumentets jonoptik. Dessa kumulativa effekter kan resultera i minskningar av jonsignalreflekterande yttopografi, snarare än de underliggande mikrobiella biokemiska interaktionerna. Agarprover måste torkas homogent och fästas starkt på ett objektglas före analys i vakuum.
Detta dokument demonstrerar ett arbetsflöde för provberedning för kontrollerad torkning av bakterieodlingsmakrokolonier odlade på agarmedia. Denna flerstegs, långsammare torkningsprocess (i förhållande till de som tidigare rapporterats) säkerställer att agaren kommer att dehydrera jämnt samtidigt som effekterna av bubbling eller sprickbildning av agarprover monterade på mikroskopglas minimeras. Genom att använda denna gradvisa torkningsmetod fästs proverna starkt på mikroskopglaset och kan användas för efterföljande matrisapplikation och MALDI-analys. Detta exemplifieras med hjälp av modellbakteriekolonier av C. difficile odlade på agar- och murina vävnadsmodeller som innehåller CDI med och utan närvaro av kommensal och opportunistisk patogen, Enterococcus faecalis. MALDI-avbildande masspektrometrianalyser av både bakterie- och vävnadsmodeller möjliggör rumslig kartläggning av aminosyrametabolitprofiler, vilket ger ny inblick i bioenergetisk mikrobiell metabolism och kommunikation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under MALDI-avbildande masspektrometri är det viktigt att ha en plan provyta för att ge en konsekvent brännvidd för den infallande MALDI-lasern på provsubstratet. Avvikelser i provhöjd kan orsaka att MALDI-laserstrålen flyttas ur fokus, vilket orsakar förändringar i stråldiameter och intensitet, vilket kan påverka MALDI-joniseringseffektiviteten. Dessa förändringar i joniseringseffektivitet kan resultera i skillnader i analytintensitet över vävnadsytan som inte reflekterar den underliggande vävnadsbiokemi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) under utmärkelsen GM138660. JTS stöddes av Charles och Monica Burkett Family Summer Fellowship från University of Florida. J.P.Z. stöddes av NIH-bidrag K22AI7220 (NIAID) och R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. stöddes av Cell and Molecular Biology Training Grant vid University of Pennsylvania (T32GM07229).
Materials
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
Riferimenti
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , (2014).
