Um Método Visual Sensível para a Detecção de Bactérias Produtoras de Sulfeto de Hidrogênio
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio com um protocolo modificado usado para precipitação de sulfeto de bismuto (BS). As principais vantagens deste método são que é fácil de avaliar e não requer equipamentos especializados.
Abstract
O sulfeto de hidrogênio (H2S) é um gás tóxico produzido por bactérias na proteólise de aminoácidos e proteínas contendo enxofre que desempenha um papel importante na saúde humana. O teste de produção de H2S é um dos importantes testes de identificação bioquímica bacteriana. Os métodos tradicionais não são apenas tediosos e demorados, mas também propensos à inibição do crescimento bacteriano devido ao efeito tóxico dos sais de metais pesados em meio contendo enxofre, o que muitas vezes leva a resultados negativos. Aqui, estabelecemos um método simples e sensível para detectar H2S em bactérias. Este método é uma versão modificada da precipitação de sulfeto de bismuto (BS) que usa placas de microtitulação transparentes de 96 poços. A cultura bacteriana foi combinada com solução de bismuto contendo L-cisteína e cultivada por 20 min, ao final do qual um precipitado negro foi observado. O limite de detecção visual para H 2 S foi de0,2mM. Com base na mudança de cor visual, a detecção simples, de alto rendimento e rápida de bactérias produtoras de H2S pode ser alcançada. Em resumo, este método pode ser usado para identificar a produção de H2S em bactérias.
Introduction
As bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio podem utilizar aminoácidos e proteínas contendo enxofre para produzir sulfeto de hidrogênio (H2S). A produção de H2S ocorre geralmente em bactérias da família Enterobacteriaceae gram-negativas e também em membros de Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp., e Shewanella spp.1. Essas bactérias têm a capacidade de reduzir o sulfato em sulfeto de hidrogênio (H2S) para obter energia. O sulfeto de hidrogênio tem sido implicado no desenvolvimento de resistência bacteriana a drogas. O H 2 S protege as bactérias da toxicidade das espécies reativas de oxigênio (EROs), antagonizando o efeito antibacteriano dos antibióticos 2,3. H2S também tem um efeito fisiológico importante na manutenção da homeostase. Em níveis suprafisiológicos, H2S tem sido mostrado para ser profundamente tóxico para o corpo. No corpo humano, H2S tem outro papel como uma molécula de sinalização de gás que está envolvida em uma variedade de processos fisiológicos e patológicos. A H2S pode regular a função sistólica do coração e desempenha importante papel fisiológico no relaxamento dos vasos sanguíneos, inibindo o remodelamento vascular e protegendo o miocárdio 4,5. A H2S também desempenha um papel importante na regulação do sistema nervoso e do trato digestivo 6,7. Verificou-se que, quando expostas a antibióticos bactericidas, as bactérias produzem espécies reativas letais de oxigênio (EROs), levando à morte celular 8,9,10,11.
Como um teste bioquímico comum em cursos de laboratório microbiológico, o teste de sulfeto de hidrogênio é um experimento importante na identificação de bactérias, especialmente bactérias da família Enterobacteriaceae. Atualmente, o teste de sulfeto de hidrogênio é geralmente realizado em um grande número de aminoácidos contendo enxofre e meio acetato de chumbo inoculado com as bactérias a serem testadas. Após um período de incubação (2-3 dias), os resultados são julgados observando-se se o meio de cultura ou a tira de papel acetato de chumbo está enegrecido devido à produção de acetato de chumbo11. No entanto, esses métodos tradicionais não são apenas tediosos e demorados, mas também propensos à inibição do crescimento bacteriano devido ao efeito tóxico de sais de metais pesados em meio contendo enxofre, o que muitas vezes leva a resultados negativos. Um método baseado em bismuto foi estabelecido para a detecção de H2S12,13. H2S pode reagir com bismuto, formando precipitação de sulfeto de bismuto preto. A fim de realizar uma reforma para este teste bioquímico, um método simples e rápido, sem efeitos colaterais sobre o crescimento bacteriano precisa ser estabelecido. Aqui, montamos um método simples para a detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio cultivadas em ambiente in vitro usando sulfeto de bismuto como substrato em um formato de placa de microtitulação de 96 poços.
Protocol
Representative Results
Discussion
O teste de produção de sulfeto de hidrogênio é um dos testes fenotípicos convencionais para a identificação e diferenciação de cepas bacterianas. Muitas espécies bacterianas podem produzir sulfeto de hidrogênio em seu ambiente natural, como a água aquática. Essas espécies bacterianas incluem Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., algumas cepas de Klebsiella sp., Escherichia coli e algumas espécies anaeróbias de Clostridia<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Desenvolvimento do Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD) e pelo Projeto de Pesquisa de Reforma do Ensino da Universidade Farmacêutica da China (2019XJYB18).
Materials
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
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