Detta är en vanligt förekommande metod för C. elegans gonaddissektion följt av frysspricka, som producerar bakterieprover för immunofluorescens via antikroppsfärgning, eller för enkel DAPI-färgning för att visualisera DNA. Detta protokoll har varit framgångsrikt för studenter i ett forskningslaboratorium och i en kursbaserad grundutbildningserfarenhet.
C. elegans germline är en utmärkt modell för att studera meios, delvis på grund av att det är enkelt att genomföra cytologiska analyser på dissekerade djur. Hela monteringspreparat bevarar strukturen hos meiotiska kärnor, och viktigare är att varje gonadarm innehåller alla stadier av meios, organiserade i en tidsmässig-rumslig progression som gör det enkelt att identifiera kärnor i olika steg. Vuxna hermafroditer har två gonadarmar, var och en organiserad som ett slutet rör med prolifererande könsstamceller vid den distala slutna änden och cellulariserade oocyter vid den proximala öppna änden, som går med i mitten vid livmodern. Dissektion släpper ut en eller båda gonadarmarna från kroppshålan, vilket gör att hela meios kan visualiseras. Här presenteras ett gemensamt protokoll för immunofluorescens mot ett protein av intresse, följt av DAPI-färgning för att markera alla kromosomer. Unga vuxna immobiliseras i levamisol och dissekeras snabbt med två sprutnålar. Efter bakteriesträngsprutning fixeras provet innan det genomgår en frysspricka i flytande kväve, vilket hjälper permeabilisera nagelbandet och andra vävnader. Provet kan sedan dehydreras i etanol, rehydreras och inkuberas med primära och sekundära antikroppar. DAPI läggs till provet i monteringsmediet, vilket möjliggör tillförlitlig visualisering av DNA och gör det enkelt att hitta djur att avbilda under ett fluorescerande mikroskop. Denna teknik används lätt av dem som är bekanta med att hantera C. elegans efter några timmars övning av själva dissektionsmetoden. Detta protokoll har lärts ut till gymnasieelever och studenter som arbetar i ett forskningslaboratorium och införlivats i en kursbaserad grundutbildningsupplevelse vid en liberal arts college.
Meios är den specialiserade celldelning som används för att skapa könsceller (ägg och spermier/pollen) i alla sexuellt reproducerande organismer 1,2. Crossover-rekombination är det ömsesidiga utbytet av DNA mellan homologa kromosomer; Det är viktigt för meios, både att tillhandahålla en viktig källa till genetisk mångfald och att främja genomstabilitet genom generationer. Kromosomer som inte bildar minst en crossover under meios kommer att separeras slumpmässigt, vilket kan resultera i kromosom nondisjunction, vilket skapar könsceller med felaktigt antal kromosomer – ett tillstånd som vanligtvis är dödligt för resulterande avkomma3. Under meios induceras crossovers genom programmerade dubbelsträngade DNA-brott4. En delmängd av dessa brott kommer att repareras som crossovers som ger fysiska kopplingar av DNA, kallad chiasmata, som hjälper till att orientera homologa kromosomer som förberedelse för celldelning5. Meiotiska stadier är mycket bevarade över alla eukaryoter, och deras kromosomala konformation gör att de lätt kan identifieras.
Som ett grundläggande begrepp inom biologi är meios ett ämne som studenter stöter på flera gånger i olika biologikurser. De introduceras ofta till mekaniken för meiotisk kromosomsegregering i gymnasiet, medan kurser på högskolenivå fokuserar på segregeringens cellbiologi och den genetiska effekten av crossover-rekombination. Meios är dock ett notoriskt knepigt begrepp för många elever1. Ett misslyckande med att förstå förhållandet mellan gener, DNA, kromosomer och meios kan generera studentmissuppfattningar och luckor i förståelsen som hindrar en fullständig förståelse av genetiskt arv 6,7. Ett sätt att förbättra elevernas förståelse för abstrakta ämnen är att tillhandahålla konkreta, praktiska aktiviteter. När lärare till exempel undervisar i meios kan de välja mellan aktiviteter som emulerar molekylär analys8, 3D-modeller som gör det möjligt för eleverna att manipulera molekyler9 eller rollspel där eleverna själva spelar ut den molekylära koreografin1. Att införliva forskning med okända resultat är ett särskilt effektivt sätt att förbättra studenternas förståelse. Denna praxis är känd som en kursbaserad grundutbildningserfarenhet (CURE) och har den extra fördelen att stärka studenternas attityder och handlingsfrihet, särskilt för dem som tillhör grupper som fortfarande är underrepresenterade i STEM10,11. Nematodmasken Caenorhabditis elegans är särskilt mottaglig för klassrumsstudier av beteende, fertilitet och genetiska korsningar och är en effektiv modell för att introducera studenter till biologisk forskning12.
C. elegans gör en kraftfull modellorganism för cellbiologi genom att kombinera molekylär genetik med enkel cytologisk analys. Det är också särskilt väl lämpat för användning i ett biologiklassrum 13,14,15. De är enkla och ekonomiska att underhålla i ett laboratorium och producerar hundratals avkommor var 3: e dag, både vid standard rumstemperatur eller vid 20 ° C, den vanligaste inkubationstemperaturen. Viktigt är att de kan frysas som glycerollager och förvaras i en frys på -80 °C, vilket innebär att eventuella djurhållningsfel som görs av nybörjare lätt kan korrigeras16. Dessutom möjliggör dess väl kommenterade genom framåt- och bakåtgenetiska tekniker17,18, vilket gör att C. elegans kan användas för att ta itu med biologiska frågor som sträcker sig från molekylära till evolutionära. Slutligen har C. elegans-forskare skapat ett stödjande samhälle som ofta är villigt att ge hjälp och råd till spirande forskare19. Dessa fördelar har lett till att C. elegans har införlivats i ett antal CUREs vid olika typer av institutioner 12,19,20,21,22,23.
Förutom dess fördelar för forskning och undervisning har C. elegans blivit en populär modell för studier av meios och bakterieutveckling24,25,26. Den optiska klarheten hos dessa djur förenklar cytologiska tillvägagångssätt27, och hos vuxna representerar gonader nästan hälften av djuret, vilket ger hundratals meiotiska celler att studera. I gonader är meiotiska bakteriekärnor anordnade som ett löpande band (figur 1); Mitotisk replikation sker vid den distala spetsen av gonaden, med kärnor som utvecklas genom meiotiska stadier när de migrerar mot den proximala änden av gonaden, där befruktade embryon kommer ut ur vulva. Eftersom den stereotypa rumsliga organisationen också representerar en tidsmässig progression genom meios, kan olika stadier lätt identifieras baserat på deras kromosomala organisation och plats i gonaden. Slutligen skapar processer som stör meios och orsakar aneuploidi fenotyper som är enkla att karakterisera, även för nybörjare: sterilitet, embryonal dödlighet eller en hög förekomst av män (honom fenotyp)28.
Detta är ett enkelt protokoll för visualisering av meiotiska kromosomer i C. elegans. Montering, dissektion, fixering och antikroppsfärgning utförs alla på samma mikroskopglas, vilket förenklar protokollet och möjliggör nästan perfekt provåtervinning. Denna metod fungerar för enkel DAPI-färgning för att visualisera kromosomer och kan användas för immunofluorescens för att visualisera lokaliseringen av proteiner i gonaden. Studenter dissekerar gonader med hjälp av grundläggande dissekeringsmikroskop, genererar helmonterade preparat för visualisering av DNA eller immunofluorescens och avbildar dem på ett sammansatt fluorescerande mikroskop. Detta protokoll har lärts ut till gymnasieelever och studenter som arbetar i ett C. elegans-forskningslaboratorium och införlivats i en CURE vid en liberal arts college12. Även om CURE hade en relativt liten klasstorlek, skulle detta protokoll vara mottagligt för klasser vid en rad institutioner på grund av den relativt låga kostnaden för maskstammar och reagenser. Instruktörer skulle endast begränsas av antalet dissekerande mikroskop som är tillgängliga för användning. Den tidigare implementeringen hade studenter som arbetade i grupper om tre för att dela ett enda mikroskop och ägde rum under tre 90-minuters sessioner: den första för att öva dissektion, den andra för att implementera dissektion och DAPI-färgning och den tredje för att bildbilder på ett fluorescensmikroskop med brett fält. Deltagande i grundforskning ger många fördelar för studenter11,29, både akademiska och personliga. Genom att bädda in forskning i kurser via CUREs kan studenter delta i forskning under normal klasstid11,30,31, vilket gör exponeringen för dessa fördelar mer tillgänglig och rättvis.
Sexuell reproduktion kräver skapandet av haploida könsceller, som produceras via den specialiserade celldelningen av meios. C. elegans har blivit en populär modell för cytologisk studie av meios på grund av dess optiska transparens, praktiska bakterieanatomi och kraftfulla genetik28. Enkla organismexperiment som bedömer fertilitet och embryonal dödlighet kan kombineras med molekylär genetik för att ta itu med många frågor i labbet eller klassrummet. Till exempel, eftersom crossovers är väsentliga för korrekt kromosomsegregering, kommer processer som stör deras bildning eller upplösning att generera aneuploida könsceller. I sin tur leder aneuploidi till oföränderlig avkomma, som lätt kan bedömas genom att räkna avkomma, eller genom den något mer komplicerade metoden för att bestämma embryonal dödlighet. Cytologiskt kommer brist på crossovers att påverka antalet DAPI-färgningskroppar som observerats under diakinesi. Robustheten i DAPI-färgning och den enkla poängsättningen gör detta till ett idealiskt experiment för att lära ut cytologiska tekniker. Den tidsmässiga rumsliga layouten av kärnor i hermafroditgrodden ger en ögonblicksbild av varje stadium av meios vid ett enda ögonblick. Kärnor tar cirka 54 timmar att fortsätta från den distala mitotiska änden av bakterien till den proximala änden (för exempel, se Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 och Libuda et al.35). Denna väletablerade tidpunkt för meiotiska framsteg möjliggör pulsjaktmärkning eller DNA-skadliga experiment.
Eftersom DAPI-färgning nästan alltid fungerar, fungerar den som en användbar teknisk kontroll för fluorescensmikroskopi (och kan ge tillfredsställelse för mikroskopister under utbildning). Antikroppsfärgning kan vara mer variabel och är ett bra mått på reproducerbarhet mellan replikat. C.elegans gonader kan vara svåra att fixa konsekvent, eftersom detta steg kräver en balans mellan att bevara kromosomal struktur samtidigt som det tillåter tillräckligt med antikroppsdiffusion. Fixering med formaldehyd bevarar bäst kromosomal morfologi, och beredning av formaldehyd färsk från paraformaldehydampuller har gett de mest reproducerbara resultaten. Det är också möjligt att använda formaldehyd framställd av formalin (37% vattenhaltig formaldehyd och metanol). Fixeringsstyrka och timing kan behöva bestämmas empiriskt för varje antikropp. Alternativa metoder innebär att man hoppar över formaldehydfixeringen i steg 2.4 och, efter fryssprickor, nedsänkning i 100% etanol vid -20 ° C, eller nedsänkning i 100% metanol i 10 minuter följt av nedsänkning i 100% aceton i 10 minuter vid -20 ° C. Dessa fixförhållanden möjliggör bättre antikroppspenetration men kommer att påverka vävnadsmorfologin negativt (kromosomer kommer att se utblåsta och puffigare ut).
Timing är mycket viktigt för dissektions- och fixstegen som beskrivs i steg 2. Eftersom volymen av dissektionslösning är så liten kan avdunstning påverka den slutliga fixkoncentrationen, vilket kommer att orsaka variabel antikroppsfärgning. En erfaren C. elegans-hanterare kan förbereda en bild på mindre än 2 minuter från början (steg 2.3) för att fixa (steg 2.4 ). Det viktigaste tekniska hindret är förmågan att plocka djur i droppen av dissektionslösning och snabbt dissekera dem. Det kan vara lättare att lära sig att dissekera i större volymer. Nya praktikanter börjar först med att plocka djur i 50-200 μl dissektionslösning i en glasfärgningsskål (figur 2D); Den bredare ytan ger mer handlingsutrymme när man identifierar en idealisk nålposition för bra Gonad-profiler, medan den större vätskevolymen gör avdunstningen mindre av ett problem. När de är bekväma med dissekeringsrörelserna börjar praktikanterna dissekera med endast 50 μL i skålen och växlar sedan till dissekering i 20 μL på en bild. När de har dissekerats på glasrutschkanor kan praktikanter snabbt börja minska mängden lösning tills de är tillräckligt snabba med att arbeta i 4 μL för att göra avdunstningen försumbar.
Om tidpunkten för dissektion fortfarande är ett problem kan praktikanter dissekera i 8 μl av dissektionslösningen under steg 2.3. Under steg 2.4 kan de sedan tillsätta 8 μl av fixlösningen, försiktigt pipettera för att blanda noggrant (noga övervaka att slaktkropparna inte störs eller pipetteras bort) och avlägsna 8 μl från den blandade lösningen. Detta alternativa tillvägagångssätt kommer att resultera i samma slutliga volym på 8 μl och samma slutliga fixkoncentration. Denna volym är viktig för att säkerställa att stommen kommer i kontakt med både täckglaset och glidytan under fryssprickan i steg 2.5. Om tidpunkten för att förbereda varje bild förblir ett problem även i större dissektionsvolymer, beskrivs en suspensionsmetod för germline immunofluorescensprotokoll av Gervaise och Arur26.
Den största begränsningen med att använda immunofluorescens för att visualisera proteiner in situ är tillgången på primära antikroppar riktade mot ett visst protein av intresse. Men om en taggad version av proteinet har konstruerats kan detta protokoll anpassas för att visualisera proteintaggen. Antikroppar som riktar sig mot vanliga taggar, som FLAG, HA eller GFP, är allmänt tillgängliga. Fluorescerande taggar som GFP kan ofta släckas genom fixeringssteg, så det rekommenderas att använda en primär antikropp riktad mot GFP, snarare än att förlita sig på själva den inbyggda fluorescenssignalen. En annan begränsning av detta protokoll är att det fångar bakterielinjen inom en enda tidsram (även om alla stadier av oogenes kommer att representeras inom bakterielinjen). Därför kan denna teknik missa dynamiska förändringar som kan uppstå när en oocyt fortskrider genom oogenes. Tidpunkten för gametogenes har dock studerats väl i C. elegans; Hos en ung vuxen av vild typ tar en oocyt cirka 60 timmar att utvecklas från den distala spetsen av bakterien (den mitotiska zonen) till diakinesis33. Därför skulle en pulsjakt eller specifikt ingrepp som bestrålning följt av en tidskurs möjliggöra observation av effekter i olika stadier av meios.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll C. elegans gonaddissektion följt av DAPI och antikroppsfärgning för fluorescensmikroskopi. Dissektion och fixering (steg 2) tar 60-90 minuter, beroende på antalet genererade bilder. Antikroppsfärgning (steg 3) är mestadels hands-off och kan variera från 7 timmar minst till 1,5 dagar, beroende på antikroppsinkubationstider. Montering (steg 4.1-4.7) tar ca 15 min. Detta allmänna tillvägagångssätt för att visualisera könskromosomer och gonaden kan användas för cytologiska studier av vilket protein som helst om det finns en antikropp eller fluorescerande taggreagens. I sin enklaste form kan DAPI-färgning av diakineskärnor användas för att screena för faktorer som påverkar meiotisk rekombination. I kombination med organismanalyser av avkommaantal, förekomsten av män (Him fenotyp) och embryonal dödlighet, ger detta cytologiska tillvägagångssätt en encells kontrapunkt till populationsbaserade analyser.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i Lee-labbet stöddes av National Institute of General Medical Sciences under prisnummer 1R15GM144861 och National Institute for Child and Human Development under prisnummer 1R15HD104115, båda National Institutes of Health. DA stöddes av UML Kennedy College of Sciences Science Scholars-programmet. NW stöddes av ett UML Honors College Fellowship och ett UMLSAMP-stipendium (finansierat av National Science Foundation under bidragsnummer HRD-1712771). Vi tackar A. Gartner för RAD-51-antikroppen. Alla C. elegans-stammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av Office of Research Infrastructure Programs vid National Institutes of Health under prisnummerP40 OD010440.
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | Molecular Probes | 711-545-152 | |
Aluminum heating/cooling block | Millipore Sigma | Z743497 | |
Bacto Peptone | Gibco | DF0118 17 0 | |
Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches | Fisherbrand | 13 678 20B | Used to make worm picks |
BSA, Bovine Serum Albumin | VWR | 97061 420 | |
C. elegans wild type (ancestral) | Caenorhabditis Genetics Center | N2 (ancestral) | |
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | VC768 | The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants. |
C. elegans spo-11 (me44) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | TY4342 | The full genotype of this strains is: spo-11(me44) IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants. |
Calcium Chloride Anhydrous | VWR | 97062 590 | |
Cholesterol | Sigma Aldrich | 501848300 | |
DAPI | Life Technologies | D1306 | |
EDTA, Disodium Dihydrate Salt | Apex Bioresearch Products | 20 147 | |
Embryo Dish, glass, 30mm cavity | Electron Microscopy Services | 100492-980 | Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
Food storage container, plastic | various | n/a | Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred |
Glass Coplin Jar | DWK Life Sciences Wheaton | 08-813E | |
Hydrophobic Barrier PAP Pen | ImmEdge | NC9545623 | |
Kimwipes | Kimtech Science | 06 666A | |
Levamisole Hydrochloride | Sigma Aldrich | L0380000 | |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Fisher Chemical | M65 500 | |
Needles, Single-use, 25 G | BD PrecisionGlide | 14 821 13D | blue, 1 inch |
NGM Agar, Granulated | Apex Bioresearch Products | 20 249NGM | |
Parafilm | Bemis | 16 101 | |
Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 50 980 487 | |
PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) | Fisher BioReagents | BP399500 | |
Petri Dishes, 60-mm | Tritech Research | NC9321999 | Non-vented, sharp edge |
Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) | Tritech Research | PT 9010 | Used to make worm picks |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium Phosphate Dibasic | VWR BDH Chemicals | BDH9266 500G | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR BDH Chemicals | BDH9268 500G | |
Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm | Fisherbrand | 12-548-AP | 0.13–0.17 mm thickness |
Razor Blades, Single Edge | VWR | 55411 055 | |
SlowFade Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | S36937 | Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging. |
Sodium Azide | Fisher BioReagents | BP922I 500 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Sigma Aldrich | 7558 79 4 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Sigma Aldrich | S9390 | |
Styrofoam box | various | n/a | Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 22 037 246 | |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 500 | |
Tryptone | Apex Bioresearch Products | 20 251 | |
Tween 20 | Fisher Chemical | BP337 500 | |
Yeast Extract | Apex Bioresearch Products | 20 254 |