आणविक मॉडलिंग दृष्टिकोण द्वारा कैसपेज़ म्यूटेशन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की खोज
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन पैकेज का उपयोग करता है और जंगली प्रकार के कैस्पेस और इसके उत्परिवर्ती रूपों के मॉडलिंग के लिए आणविक गतिशीलता (एमडी) दृष्टिकोण का वर्णन करता है। एमडी विधि कैसपेस संरचना के गतिशील विकास और उत्परिवर्तन या पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के संभावित प्रभाव का आकलन करने की अनुमति देती है।
Abstract
एपोप्टोसिस एक प्रकार का क्रमादेशित कोशिका मृत्यु है जो क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को समाप्त करता है और बहुकोशिकीय जीवों के विकास और ऊतक होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है। कैसपेस, सिस्टीन प्रोटीज का एक परिवार, एपोप्टोसिस दीक्षा और निष्पादन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कैसपेस की परिपक्वता और उनकी गतिविधि को अत्यधिक गतिशील तरीके से पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा ठीक किया जाता है। पोस्ट-ट्रांसलेशनल परिवर्तनों के प्रभाव का आकलन करने के लिए, संभावित साइटों को नियमित रूप से किसी भी संशोधन के लिए लगातार अवशेषों के साथ उत्परिवर्तित किया जाता है। उदाहरण के लिए, सेरीन अवशेषों को एलानिन या एस्पार्टिक एसिड के साथ बदल दिया जाता है। हालांकि, इस तरह के प्रतिस्थापन कैसपेस सक्रिय साइट की रचना को बदल सकते हैं, जिससे उत्प्रेरक गतिविधि और सेलुलर कार्यों में गड़बड़ी हो सकती है। इसके अलावा, महत्वपूर्ण पदों में स्थित अन्य अमीनो एसिड अवशेषों के उत्परिवर्तन भी कैसपेस की संरचना और कार्यों को तोड़ सकते हैं और एपोप्टोसिस गड़बड़ी का कारण बन सकते हैं। उत्परिवर्तित अवशेषों को नियोजित करने की कठिनाइयों से बचने के लिए, कैसपेस संरचना पर अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के संभावित प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए आणविक मॉडलिंग दृष्टिकोण आसानी से लागू किए जा सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रोटीन संरचना और कार्य पर उत्परिवर्तन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन पैकेज (एम्बर) और सुपर कंप्यूटर सुविधाओं के साथ जंगली-प्रकार के कैस्पेस और इसके उत्परिवर्ती रूपों दोनों के मॉडलिंग की अनुमति देता है।
Introduction
एपोप्टोसिस सबसे व्यापक रूप से अध्ययन की जाने वाली सेलुलर प्रक्रियाओं में से एक है जो बहुकोशिकीय जीवों के मोर्फोजेनेसिस और ऊतक होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है। एपोप्टोसिस बाहरी या आंतरिक उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा शुरू किया जा सकता है, जैसे कि मृत्यु रिसेप्टर्स की सक्रियता, कोशिका चक्र संकेतों में गड़बड़ी, डीएनए क्षति, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव, और विभिन्न जीवाणु और वायरल संक्रमण1। कैसपेस – प्रमुख एपोप्टोटिक खिलाड़ी – को पारंपरिक रूप से दो समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: सर्जक (कैस्पेज़ -2, कैसपेज़ -8, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -10) और प्रभावक (कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6, और कैसपेज़ -7), उनकी डोमेन संरचना और कैसपेज़ कैस्केड 2,3 में जगह के आधार पर। कोशिका मृत्यु संकेतों पर, आरंभकर्ता कैसपेस एडाप्टर अणुओं के साथ बातचीत करते हैं जो एक सक्रिय एंजाइम बनाने के लिए निकटता-प्रेरित डिमराइजेशन और ऑटोप्रोसेसिंग की सुविधा प्रदान करते हैं। प्रभावक कैसपेस को आरंभकर्ता कैसपेज़ द्वारा दरार के माध्यम से सक्रिय किया जाता है और कई सेलुलर सब्सट्रेट्स को छोड़कर डाउनस्ट्रीम निष्पादनचरणों का प्रदर्शन किया जाता है।
आरंभकर्ता और प्रभावक कैसपेस की परिपक्वता और कार्य को बड़ी संख्या में विभिन्न इंट्रासेल्युलर तंत्रों द्वारा विनियमित किया जाता है, जिनमें से पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन सेल डेथ मॉड्यूलेशन 5 में एक अनिवार्य भूमिका निभाताहै। संशोधित समूहों (फॉस्फोराइलेशन, नाइट्रोसिलेशन, मिथाइलेशन, या एसिटिलीकरण) या प्रोटीन (सर्वव्यापी या सूमोनाइलेशन) के अलावा कैसपेस की एंजाइमेटिक गतिविधि या प्रोटीन रचना और स्थिरता जो एपोप्टोसिस को नियंत्रित करते हैं। साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस को व्यापक रूप से संभावित पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन साइटों की जांच करने और उनकी भूमिका को समझने के लिए लागू किया जाता है। एक कथित संशोधन साइट को आमतौर पर एक अन्य एमिनो एसिड द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जिसे आगे संशोधित नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, संभावित फॉस्फोराइलेटेड सेरीन और थ्रेओनिन को एलानिन में उत्परिवर्तित किया जाता है, और लाइसिन सर्वव्यापी साइटों को आर्जिनिन के साथ बदल दिया जाता है। एक अन्य रणनीति में एक एमिनो एसिड को प्रतिस्थापित करना शामिल है जो विशेष रूप से पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की नकल करता है (उदाहरण के लिए, ग्लूटामेट और एस्पार्टेट का उपयोग फॉस्फोराइलेटेड सेरीन या थ्रेओनिन की नकल करने के लिए किया गया है) 6। हालांकि, एक सक्रिय साइट के उच्च आसपास के क्षेत्र में या महत्वपूर्ण पदों में स्थित इनमें से कुछ प्रतिस्थापन कैसपेस संरचना को बदल सकते हैं, उत्प्रेरक गतिविधि को परेशान कर सकते हैं, और एपोप्टोटिक सेल मृत्यु को दबासकते हैं। कैसपेज़ जीन में ट्यूमर से जुड़े गलत समझ उत्परिवर्तन के मामलों में इसी तरह के प्रभाव देखे जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, कैसपेज़ -6 – आर 259 एच के ट्यूमर से जुड़े उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप सब्सट्रेट-बाइंडिंग जेब में लूप के विरूपण परिवर्तन हुए, जिससे सब्सट्रेट 8 के कुशल उत्प्रेरक कारोबार को कम कियागया। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में पहचाने गए कैसपेज़ -8 में जी 325 ए एमिनो एसिड प्रतिस्थापन कैसपेज़ -8 गतिविधि को बाधित कर सकता है, जिसके कारण परमाणु कारक-केबी (एनएफ-केबी) सिग्नलिंग का मॉड्यूलेशन हुआ और ट्यूमरजेनिसिस9 को बढ़ावा मिला।
कैसपेस संरचना और कार्य पर अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के संभावित प्रभाव का आकलन करने के लिए, आणविक मॉडलिंग लागू की जा सकती है। आणविक गतिशीलता (एमडी) दृष्टिकोण को बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन पैकेज (एम्बर) का उपयोग करके जंगली-प्रकार के कैसपेज़ और इसके उत्परिवर्ती रूपों के मॉडलिंग के लिए इस काम में वर्णित किया गया है। एमडी विधि उत्परिवर्तन की शुरूआत के बाद प्रोटीन संरचना के गतिशील विकास का एक दृश्य देती है। मूल रूप से पीटर कोलमैन के समूह द्वारा विकसित, एम्बर पैकेज बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन10,11,12,13 के लिए सबसे लोकप्रिय सॉफ्टवेयर टूल में से एक बन गया। इस सॉफ्टवेयर को दो भागों में विभाजित किया गया है: (1) एम्बरटूल्स, सिस्टम तैयारी के लिए नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले कार्यक्रमों का एक संग्रह (परमाणु प्रकार असाइनमेंट, हाइड्रोजन और स्पष्ट-पानी के अणुओं को जोड़ना, आदि) और प्रक्षेपवक्र विश्लेषण; और (2) एम्बर, जो पीएमएमडी सिमुलेशन प्रोग्राम के आसपास केंद्रित है। एम्बरटूल्स एक मुफ्त पैकेज है (और एम्बर को स्थापित करने के लिए एक शर्त है), जबकि एम्बर को एक अलग लाइसेंस और शुल्क संरचना के साथ वितरित किया जाता है। सुपर कंप्यूटर पर समानांतर सिमुलेशन और / या ग्राफिक्स प्रोसेसिंग यूनिट (जीपीयू) का उपयोग प्रोटीन संरचना गतिशीलता 14 के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए प्रदर्शन में काफी सुधार करसकता है। नवीनतम उपलब्ध सॉफ़्टवेयर संस्करण AmberTools21 और Amber20 हैं, लेकिन वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग पूर्व संस्करणों के साथ भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित एमडी दृष्टिकोण बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन पैकेज का उपयोग करके कैसपेज़ के जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती दोनों रूपों को मॉडलिंग करने की अनुमति देता है। कार्यप्रणाली के कई महत्वपूर्ण मुद्दों पर यह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रूसी विज्ञान फाउंडेशन (17-75-20102, प्रोटोकॉल विकास) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग (फॉस्फोराइलेशन का विश्लेषण) में वर्णित प्रयोगों को स्टॉकहोम (181301) और स्वीडिश (190345) कैंसर सोसाइटी द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
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