Detta protokoll beskriver att göra ett stort (6 x 3 mm2) kranialfönster med matfolie, transparent silikon och täckglas. Detta kranialfönster tillåter in vivo bredfälts- och tvåfotonkalciumavbildningsexperiment i samma mus.
Bredfältkalciumavbildning från musens neocortex gör att man kan observera cortexomfattande neural aktivitet relaterad till olika hjärnfunktioner. Å andra sidan kan tvåfotonavbildning lösa aktiviteten hos lokala neurala kretsar på encellsnivå. Det är viktigt att göra ett stort kranialfönster för att utföra analys i flera skalor med båda bildteknikerna i samma mus. För att uppnå detta måste man ta bort en stor del av skallen och täcka den exponerade kortikala ytan med transparenta material. Tidigare har glasskallar och polymerbaserade kranialfönster utvecklats för detta ändamål, men dessa material är inte lätt att tillverka. Detta protokoll beskriver en enkel metod för att göra ett stort kranialfönster bestående av kommersiellt tillgänglig polyvinylidenklorid (PVDC) omslagsfilm, en transparent silikonplugg och ett täckglas. För avbildning av dorsalytan på en hel halvklot var fönsterstorleken cirka 6 x 3 mm2. Svåra hjärnvibrationer observerades inte trots ett så stort fönster. Det är viktigt att hjärnytans tillstånd inte försämrades i mer än en månad. Wide-field imaging av en mus som uttrycker en genetiskt kodad kalciumindikator (GECI), GCaMP6f, speciellt i astrocyter, avslöjade synkroniserade svar på några millimeter. Tvåfotonavbildning av samma mus visade framträdande kalciumsvar hos enskilda astrocyter under flera sekunder. Vidare applicerades ett tunt lager av ett adenoassocierat virus på PVDC-filmen och uttryckte framgångsrikt GECI i kortikala neuroner över kranialfönstret. Denna teknik är pålitlig och kostnadseffektiv för att göra ett stort kranialfönster och underlättar undersökningen av neural- och glialdynamiken och deras interaktioner under beteende på makroskopiska och mikroskopiska nivåer.
Bredfältskalciumavbildning undersöker effektivt det spatiotemporala aktivitetsmönstret över ett stort område av djurhjärnan 1,2,3. Vidfältsavbildning har använts i stor utsträckning för att observera gnagares hela kortikala yta eftersom deras cortex är relativt platt 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Transgena möss eller möss injicerade med adenoassocierat virus (AAV), som specifikt uttrycker GECI i olika celler såsom neuroner och gliaceller, kan användas för bredfältkalciumavbildning11,12,13. Den rumsliga upplösningen av denna teknik är emellertid vanligtvis inte tillräcklig för att lösa aktiviteten hos enskilda celler in vivo14. Det är inte heller lämpligt för avbildning av celler som ligger i djupare lager.
Å andra sidan kan tvåfotonkalciumavbildning observera aktiviteten hos flera celler samtidigt med subcellulär rumslig upplösning, vilket möjliggör observation av aktiviteten hos enskilda celler även i neuronala dendriter och glialprocesser 15,16,17,18,19,20,21,22. Det kan också observera celler i djupare lager av hjärnbarken23,24. Även om de senaste tekniska framstegen inom tvåfotonmikroskopi möjliggör avbildning från millimeterbreda kortikala regioner 25,26,27,28,29, är det fortfarande svårt att observera ett område som kan jämföras med bredfältsavbildning genom tvåfotonavbildning.
För att förstå den fysiologiska relevansen av hjärnaktivitet från encell till hel hjärna är det viktigt att överbrygga klyftan mellan aktiviteten hos kortikala regioner över hela cortex och den vid encellsupplösning i lokala neurala kretsar. Därför är en kombination av bredfälts- och tvåfotonkalciumavbildning utförd i samma mus särskilt effektiv. För att förverkliga detta måste ett brett och stabilt kranialfönster skapas, helst under en lång period.
Tidigare har flera tekniker för att tillverka kranialfönster utvecklats för att möjliggöra bredfälts- och tvåfotonavbildning i samma mus30,31. Trapetsformade täckglasfönster (kristallskalle), som är gjutna i form av den kortikala ytan för att ersätta det borttagna benet, tillåter optisk åtkomst över hela cortex32. Alternativt kan polymerbaserade kranialfönster tillverkas med polyetentereftalat (PET)33 eller polyetenoxidbelagda amorfa fluorpolymerer nanoark34. Varje metod har visat sig upprätthålla ett stabilt fönster i mer än 1 månad. Att producera dessa fönster är dock inte lätt, och de material och utrustning som används är ofta dyra.
Den aktuella studien beskriver en ny metod för att göra ett stort kranialfönster med PVDC-filmen (plastmatfolie) (figur 1). Med hjälp av detta fönster kan in vivo bredfälts- och tvåfotonavbildningsexperiment utföras i samma möss. Det har också visats att GECIs kan uttryckas i neuroner över ett brett område av cortex hos möss genom att bilda ett tunt lager film som innehåller AAV-partiklar på omslaget.
Den här artikeln presenterar en billig metod för att skapa ett stort kranialfönster med en PVDC-plastfolie, transparent silikon och täckglas. Med hjälp av denna metod visade vi att kalciumavbildning med brett fält kunde utföras över ett brett område av hjärnbarken. Tvåfotonkalciumavbildning kan utföras från flera olika kortikala regioner i samma mus som har genomgått vidfältsavbildning. Dessutom har det visat sig att en fibroin-AAV-film på plastfolien som används för fönstret kan uttrycka GECI över ett brett område av cortex.
Kritiska steg
Det är viktigt att undvika infektion och skador på hjärnan när man gör kranialfönster med plastfolie. Under dessa förhållanden kan neural och glial aktivitet inte observeras, och avbildning av djupare områden är omöjlig. Skador på blodkärlen resulterar också i blödning, vilket gör avbildning omöjlig på grund av blod. För att undvika infektion är det viktigt att göra hjärnytan och omslaget fäst så tätt som möjligt genom att suga ut ACSF. Mannitol administrering är viktigt för att undvika skador på hjärnan och blodkärlen genom att förhindra ökat hjärntryck under operationen. Detta upprätthåller utrymmet mellan hjärnans yta och dura mater och förhindrar att hjärnan och blodkärlen berörs under avlägsnandet av skallen och dura mater. Ett stereomikroskop med hög förstoring och pincett med skarpa spetsar är också effektiva för noggrann operation.
I fibroin-AAV-metoden är det viktigt att använda köttsilkesmaskkokonger, att inte frysa fibroinlösning, att torka fibroin-AAV-lösningen tillräckligt och att applicera tillräcklig volym lösning (5 μL per 3 mm diameter). När äldre kokonger användes var uttryckseffektiviteten lägre. Detta beror på att fibroin från gamla kokonger lätt kan denatureras. När fibroinlösningen frystes vid -80 °C och tinades vid användningstillfället var uttryckseffektiviteten dålig. Detta kan bero på denatureringen av proteinet på grund av frysning och upptining. Eftersom fibroinlösningar som lagras vid 4 °C kan användas effektivt fram till gelering rekommenderas att fibroinlösningar hålls kylda och renade från kokonger igen efter gelering. Fibroin-AAV-lösningen bör torkas i minst 3 timmar, eftersom uttrycket är dåligt efter mindre än 3 timmar. Slutligen beror uttrycksområdet på mängden fibroin-AAV-lösning som används. I exemplet i figur 3M var mängden liten (5 μL); Således täckte fibroin-AAV-filmen endast den övre halvan av fönstret, vilket resulterade i ojämnt uttryck över fönstret. Om en tillräcklig mängd fibroin-AAV används kommer uttrycket att vara enhetligt över hela fönstret.
Modifieringar av tekniken
Den nya kranialfönstertekniken gör det möjligt för en att undersöka den makroskopiska aktiviteten hos kortikala kretsar och deras underliggande aktivitet på encellsnivå i samma mus. Således kan metoden tillämpas på en mängd olika neurovetenskapliga studier. Det kan till exempel användas för att observera kortikal aktivitet under beslutsfattande uppgifter, motorisk inlärning och i musmodeller av hjärnskada och sjukdom. Vi tror också att metoden kan tillämpas inte bara på gnagare utan också på icke-mänskliga primater.
Detta papper visar att det stora kranialfönstret är effektivt för avbildning av transgena möss och möss injicerade med AAV som uttrycker funktionella proteiner. I synnerhet visas att fibroin-AAV-filmen på omslaget är mycket enklare än en konventionell AAV-injektionsmetod för att uttrycka GECIs över det breda området av cortex. Med hjälp av en blandning av två AAV som kodar för GECIs i olika färger41 kan korrelationen mellan neuron och glialcellsaktivitet samtidigt avbildas över ett brett område av cortex. Dessutom kan fibroin-AAV-filmmetoden också tillämpas på andra genetiskt kodade biosensorer 42,43,44,45,46,47.
Det större kranialfönstret, som kan avbilda båda halvklotet, är också möjligt. Tvåfotonmikroskop med ett mycket bredare synfält (~ 25 mm2) har nyligen utvecklats 25,26,27,28,29. Genom att kombinera denna tvåfotonavbildningsteknik med en-foton-bredfältsavbildning med hjälp av det breda kranialfönstret som beskrivs här kan vi undersöka förhållandet mellan befolkningsaktivitet och encellsaktivitet från oöverträffade skalor.
Begränsningar
Matförpackningen tillåter inga ämnen att passera igenom. Detta gör metoden svår att använda för farmakologiska experiment. Det är också svårt att ta bort omslaget, vilket gör det omöjligt att sätta in en glaspipett eller elektrod. Därför är det svårt att genomföra experiment i kombination med andra metoder såsom samtidig kalciumavbildning och elektrofysiologiska inspelningar och lokal administrering av läkemedel med hjälp av en glaspipett. En möjlig lösning för dessa begränsningar är att använda omslaget och glasfönstret med ett hål. Detta ger tillgång till hjärnan via en glaspipett eller en inspelningselektrod samtidigt som kranialfönstret hålls sterilt under en lång period48.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) ‘Glial Decoding’ (JP21H05621 till SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 till SM, 15KK0340 till ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 till HB och JP17H06313 till KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 till SM, JP19dm0207079 till HB och JP19dm0207080 till KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (till SM), Bidrag för ung forskare från Yamanashi Prefecture (till SM) och Takeda Science Foundation (till SM) och delvis stöds av The Frontier Brain Research Grant från Univ.
Vi tackar N. Yaguchi och K. Okazaki för djurvård och tekniskt bistånd och medlemmar i Kitamura-labbet för hjälpsamma diskussioner.
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
50 mL beaker | |||
Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
ACSF aspiration needle | |||
Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Cotton swab | |||
Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
Digital scale | Dretec | KS-243 | |
Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
Glass pipette | custom-made | ||
Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
Heating pad | |||
Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Mixing tip | GC | ||
Needle (30 G) | |||
Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
Scalpel | Kai | No. 11 | |
Shaver for animal | |||
Silicone dispensers | GC | ||
Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
||
Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |