Her præsenteres en protokol for at opbygge et hurtigt og ikke-destruktivt system til måling af celle- eller kernekompressibilitet baseret på akustofluidisk mikroenhed. Ændringer i tumorcellernes mekaniske egenskaber efter epitel-mesenkymal overgang eller ioniserende stråling blev undersøgt, hvilket demonstrerede anvendelsesudsigten for denne metode i videnskabelig forskning og klinisk praksis.
Cellemekanik spiller en vigtig rolle i tumormetastase, ondartet transformation af celler og radiofølsomhed. Under disse processer er det ofte udfordrende at studere cellernes mekaniske egenskaber. Konventionelle målemetoder baseret på kontakt såsom kompression eller strækning er tilbøjelige til at forårsage celleskader, hvilket påvirker målenøjagtigheden og efterfølgende cellekultur. Målinger i vedhæftet tilstand kan også påvirke nøjagtigheden, især efter bestråling, da ioniserende stråling vil flade celler og forbedre vedhæftningen. Her er der udviklet et cellemekanisk målesystem baseret på akustofluidisk metode. Cellekompressibiliteten kan opnås ved at registrere cellebevægelsesbanen under virkningen af den akustiske kraft, som kan realisere hurtig og ikke-destruktiv måling i suspenderet tilstand. Dette papir rapporterer detaljeret protokollerne for chipdesign, prøveforberedelse, baneregistrering, parameterekstraktion og analyse. Kompressibiliteten af forskellige typer tumorceller blev målt ud fra denne metode. Måling af kernens kompressibilitet blev også opnået ved at justere resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik og mikrokanalens bredde. Kombineret med verifikation på molekylært niveau af immunfluorescensforsøg blev cellekompressibiliteten før og efter lægemiddelinduceret epitel til mesenkymal overgang (EMT) sammenlignet. Endvidere blev ændringen af cellekompressibilitet efter røntgenbestråling med forskellige doser afsløret. Cellemekanik målemetoden, der foreslås i dette papir, er universel og fleksibel og har brede anvendelsesmuligheder inden for videnskabelig forskning og klinisk praksis.
Cellemekaniske egenskaber spiller en vigtig rolle i tumormetastase, ondartet transformation af celler og radiosensitivitet 1,2. For at få en dybdegående forståelse af cellemekaniske egenskabers rolle i ovenstående proces er nøjagtig måling af cellulær mekanik kritisk, og målingen bør ikke forårsage skade på cellerne til efterfølgende dyrkning og analyse. Måleprocessen skal være så hurtig som muligt, ellers kan cellelevedygtigheden blive påvirket, hvis celler fjernes fra dyrkningsmiljøet i lang tid.
Eksisterende cellemekaniske målemetoder står over for nogle begrænsninger. Nogle metoder, såsom magnetisk vridningscytometri, magnetisk pincet og partikelsporingsmikroreologi, forårsager celleskader på grund af indførelsen af partikler i celler 3,4,5. Metoder, der måler ved kontakt med celler, såsom atomkraftmikroskop (AFM), mikropipetteaspiration, mikroindsnævring og parallelpladeteknik, er også tilbøjelige til celleskader, og gennemstrømningen er vanskelig at øge 6,7,8. Derudover vil ioniserende stråling flade celler og øge deres vedhæftning9; Det er derfor nødvendigt at måle helcellemekanik i suspension.
Som svar på ovenstående udfordringer er der udviklet et cellemekanikmålesystem baseret på acoustofluidisk metode 10,11,12,13,14. Kanalbredden matches med den akustiske halvbølgelængde, hvilket skaber en stående bølgeknude ved mikrokanalens midterlinje. Under virkningen af akustisk strålingskraft kan cellerne eller standardperlerne flytte til den akustiske trykknude. Da standardperlernes fysiske egenskaber (størrelse, densitet og kompressibilitet) er kendt, kan den akustiske energitæthed bestemmes. Derefter kan cellekompressibiliteten opnås ved at registrere bevægelsesbanerne for celler i det akustiske felt. Ikke-destruktiv måling af høj kapacitet af celler i suspensionstilstand kan opnås. Dette papir vil introducere designet af den mikrofluidiske chip, etableringen af systemet og måletrinnene. Måling af forskellige typer tumorceller er blevet udført for at verificere metodens nøjagtighed. Anvendelsesområdet for denne metode var blevet udvidet til subcellulære strukturer (såsom kerne) ved at justere resonansfrekvensen af den piezoelektriske keramik og bredden af mikrokanalen. Desuden blev ændringerne i cellekompressibilitet efter lægemiddelinduceret EMT eller røntgenbestråling med forskellige doser undersøgt. Resultaterne viser den brede anvendelighed af denne metode som et kraftfuldt værktøj til at studere sammenhængen mellem biokemiske ændringer og cellulære mekaniske egenskaber.
Almindeligt anvendte cellemekaniske målemetoder er AFM, mikropipetteaspiration, mikrofluidikmetoder, parallelpladeteknik, optisk pincet, optisk båre og akustiske metoder20. Microfluidics-metoder kan arbejde med tre tilgange: mikroindsnævring, ekstensiv strømning og forskydningsstrøm. Blandt dem er optisk båre, optisk pincet, akustiske metoder, ekstensiv strømning og forskydningsstrømningsmetoder ikke-kontaktmålinger. I modsætning til kontaktmålinger kan berøringsfri målinger effektivt…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskudsnumre 12075330 og U1932165) og Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (tilskudsnummer 2020A1515010270).
0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
Heat-resistant glass | Pyrex | ||
Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
Trypan Blue | Beyotime | C0011 |