מדידת הדחיסות של תאים וגרעין על בסיס מיקרו-מכשיר אקוסטופלואידי
Summary
כאן מוצג פרוטוקול לבניית מערכת מהירה ולא הרסנית למדידת דחיסות התא או הגרעין על בסיס מיקרו-מכשיר אקוסטופלואידי. נחקרו שינויים בתכונות המכניות של תאי הגידול לאחר מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי או קרינה מייננת, המדגימים את סיכויי היישום של שיטה זו במחקר מדעי ובפרקטיקה הקלינית.
Abstract
מכניקת התאים ממלאת תפקיד חשוב בגרורות סרטניות, טרנספורמציה ממאירה של תאים, ורגישות רדיו. במהלך תהליכים אלה, חקר התכונות המכניות של התאים הוא לעתים קרובות מאתגר. שיטות מדידה קונבנציונליות המבוססות על מגע כגון דחיסה או מתיחה מועדות לגרום נזק לתאים, ומשפיעות על דיוק המדידה ועל תרבית התאים שלאחר מכן. מדידות במצב דבק יכולות גם הן להשפיע על הדיוק, במיוחד לאחר הקרנה מכיוון שקרינה מייננת תשטח תאים ותגביר את ההדבקה. כאן פותחה מערכת מדידה של מכניקת התא המבוססת על שיטה אקוסטופלואידית. ניתן להשיג את דחיסות התא על ידי רישום מסלול תנועת התא תחת פעולת הכוח האקוסטי, אשר יכול לממש מדידה מהירה ולא הרסנית במצב מושעה. מאמר זה מדווח בפירוט על הפרוטוקולים לתכנון שבבים, הכנת דגימה, הקלטת מסלול, חילוץ וניתוח פרמטרים. הדחיסות של סוגים שונים של תאי גידול נמדדה על בסיס שיטה זו. מדידת הדחיסות של הגרעין הושגה גם על ידי התאמת תדר התהודה של הקרמיקה הפיאזואלקטרית ורוחב המיקרו-ערוץ. בשילוב עם אימות ברמה המולקולרית של ניסויים אימונופלואורסצנטיים, הושוו דחיסות התאים לפני ואחרי מעבר אפיתל למעבר מזנכימלי (EMT) המושרה על ידי תרופות. יתר על כן, השינוי של דחיסות התא לאחר קרינת רנטגן עם מינונים שונים נחשף. שיטת המדידה של מכניקת התא המוצעת במאמר זה היא אוניברסלית וגמישה ויש לה סיכויי יישום נרחבים במחקר מדעי ובפרקטיקה הקלינית.
Introduction
תכונות מכניות של תאים ממלאות תפקיד חשוב בגרורות סרטניות, טרנספורמציה ממאירה של תאים, ורגישות רדיו-רגישות 1,2. כדי לקבל הבנה מעמיקה של תפקידן של התכונות המכניות של התא בתהליך הנ”ל, מדידה מדויקת של מכניקת התאים היא קריטית, והמדידה לא אמורה לגרום נזק לתאים לצורך תרבית וניתוח עתידיים. תהליך המדידה צריך להיות מהיר ככל האפשר, אחרת הכדאיות של התאים עלולה להיות מושפעת אם תאים מוסרים מסביבת הטיפוח במשך זמן רב.
שיטות המדידה הקיימות של מכניקת התאים מתמודדות עם מגבלות מסוימות. שיטות מסוימות, כגון ציטומטריה של פיתול מגנטי, פינצטה מגנטית ומיקרורולוגיה העוקבת אחר חלקיקים, גורמות נזק לתאים עקב החדרת חלקיקים לתאים 3,4,5. שיטות המודדות על ידי מגע עם תאים, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), שאיפת מיקרו-פיפטה, מיקרו-התכווצות וטכניקת לוחות מקבילים, מועדות גם הן לפגיעה בתאים וקשה להגדיל את התפוקה ב-6,7,8. בנוסף, קרינה מייננת תשטח תאים ותגביר את הידבקותם9; לכן יש צורך למדוד מכניקה של תאים שלמים בהשעיה.
בתגובה לאתגרים הנ”ל, פותחה מערכת מדידה של מכניקת התא המבוססת על שיטה אקוסטופלואידית 10,11,12,13,14. רוחב הערוץ מותאם לחצי אורך הגל האקוסטי, ובכך יוצר צומת גל עומד בקו האמצע של המיקרו-ערוץ. תחת פעולה של כוח קרינה אקוסטית, התאים או חרוזים סטנדרטיים יכולים לעבור לצומת הלחץ האקוסטי. מכיוון שהתכונות הפיזיקליות של החרוזים הסטנדרטיים (גודל, צפיפות ודחיסות) ידועות, ניתן לקבוע את צפיפות האנרגיה האקוסטית. לאחר מכן, ניתן להשיג את דחיסות התאים על ידי רישום מסלולי התנועה של תאים בשדה האקוסטי. ניתן להשיג מדידה לא הרסנית בתפוקה גבוהה של תאים במצב השעיה. מאמר זה יציג את העיצוב של השבב המיקרופלואידי, הקמת המערכת ושלבי המדידה. מדידה של סוגים שונים של תאים סרטניים בוצעה כדי לאמת את הדיוק של השיטה. היקף היישום של שיטה זו הורחב למבנים תת-תאיים (כגון גרעין) על ידי התאמת תדר התהודה של הקרמיקה הפיאזואלקטרית ורוחב המיקרו-ערוץ. בנוסף, נחקרו השינויים בדחיסות התאים לאחר EMT הנגרם על ידי תרופות או קרינת רנטגן במינונים שונים. התוצאות מדגימות את הישימות הרחבה של שיטה זו ככלי רב עוצמה לחקר הקשר בין שינויים ביוכימיים לבין תכונות מכניות של תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות מדידה נפוצות במכניקת התא הן AFM, שאיפת מיקרו-פיפטה, שיטות מיקרופלואידיות, טכניקת לוחות מקבילים, פינצטה אופטית, אלונקה אופטית ושיטות אקוסטיות20. שיטות מיקרופלואידיקה יכולות לעבוד עם שלוש גישות: מיקרו-כיווץ, זרימה מאריכה וזרימת גזירה. ביניהם, אלונקה אופטית, פינצטה אופטית, שי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 12075330 ו- U1932165) והקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מענק מספר 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
Riferimenti
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
- Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
- Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
- Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
- Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
- Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Jung, J. -. W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
- Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
- Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
- Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
- Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
- Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
- Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
- Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
- Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
- Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
- Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
- Wei, M. -. T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
- Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
- Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
- Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
- Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).
