Измерение сжимаемости клеток и ядер на основе акустофлюидного микроустройства
Summary
Здесь представлен протокол построения быстрой и неразрушающей системы измерения сжимаемости клеток или ядер на основе акустофлюидного микроустройства. Исследованы изменения механических свойств опухолевых клеток после эпителиально-мезенхимального перехода или ионизирующего излучения, демонстрирующие перспективу применения данного метода в научных исследованиях и клинической практике.
Abstract
Клеточная механика играет важную роль в метастазировании опухоли, злокачественной трансформации клеток и радиочувствительности. Во время этих процессов изучение механических свойств клеток часто является сложной задачей. Обычные методы измерения, основанные на контакте, такие как сжатие или растяжение, склонны вызывать повреждение клеток, влияя на точность измерения и последующую культуру клеток. Измерения в адгезивном состоянии также могут влиять на точность, особенно после облучения, поскольку ионизирующее излучение сплющивает клетки и усиливает адгезию. Здесь разработана система измерения клеточной механики на основе акустофлюидного метода. Сжимаемость ячейки может быть получена путем записи траектории движения ячейки под действием акустической силы, которая может осуществлять быстрое и неразрушающее измерение в подвешенном состоянии. В этой статье подробно описываются протоколы проектирования чипов, подготовки образцов, регистрации траектории, извлечения и анализа параметров. На основе этого метода измеряли сжимаемость различных типов опухолевых клеток. Измерение сжимаемости ядра также достигалось путем регулировки резонансной частоты пьезоэлектрической керамики и ширины микроканала. В сочетании с проверкой на молекулярном уровне экспериментов с иммунофлуоресценцией сравнивали сжимаемость клеток до и после лекарственно-индуцированного эпителиального перехода в мезенхимальный переход (ЭМТ). Далее выявлено изменение сжимаемости клеток после рентгеновского облучения различными дозами. Предложенный в данной работе метод измерения клеточной механики является универсальным и гибким и имеет широкие перспективы применения в научных исследованиях и клинической практике.
Introduction
Механические свойства клеток играют важную роль в метастазировании опухоли, злокачественной трансформации клеток и радиочувствительности 1,2. Чтобы получить глубокое понимание роли механических свойств клеток в вышеуказанном процессе, точное измерение клеточной механики имеет решающее значение, и измерение не должно вызывать повреждения клеток для последующей культивирования и анализа. Процесс измерения должен быть как можно более быстрым, в противном случае жизнеспособность клеток может пострадать, если клетки будут удалены из среды культивирования на длительное время.
Существующие методы измерения клеточной механики сталкиваются с некоторыми ограничениями. Некоторые методы, такие как магнитная скручивающая цитометрия, магнитный пинцет и микрореология отслеживания частиц, вызывают повреждение клеток из-за введения частиц в клетки 3,4,5. Методы, которые измеряют путем контакта с клетками, такие как атомно-силовой микроскоп (AFM), аспирация микропипетки, микросужение и метод параллельных пластин, также подвержены повреждению клеток, и пропускную способность трудно увеличитьна 6,7,8. Кроме того, ионизирующее излучение будет сплющивать клетки и увеличивать их адгезию9; поэтому необходимо измерить механику целых клеток в суспензии.
В ответ на вышеуказанные вызовы была разработана система измерения клеточной механики на основе акустофлюидного метода10,11,12,13,14. Ширина канала соответствует акустической половине длины волны, создавая таким образом узел стоячей волны на средней линии микроканала. Под действием силы акустического излучения ячейки или стандартные шарики могут перемещаться к узлу акустического давления. Поскольку физические свойства стандартных шариков (размер, плотность и сжимаемость) известны, плотность акустической энергии может быть определена. Затем сжимаемость ячейки может быть получена путем записи траекторий движения клеток в акустическом поле. Может быть достигнуто неразрушающее высокопроизводительное измерение ячеек в состоянии суспензии. В этом документе будет представлен дизайн микрофлюидного чипа, создание системы и этапы измерения. Измерение различных типов опухолевых клеток было проведено для проверки точности метода. Область применения этого метода была распространена на субклеточные структуры (такие как ядро) путем регулировки резонансной частоты пьезоэлектрической керамики и ширины микроканала. Кроме того, исследованы изменения сжимаемости клеток после медикаментозного ЭМТ или рентгеновского облучения различными дозами. Полученные результаты демонстрируют широкую применимость данного метода как мощного инструмента для изучения корреляции между биохимическими изменениями и клеточными механическими свойствами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обычно используемыми методами измерения клеточной механики являются AFM, аспирация микропипетки, методы микрофлюидики, метод параллельной пластины, оптический пинцет, оптические носилки и акустические методы20. Методы микрофлюидики могут работать с тремя подходами: микро?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (номера грантов 12075330 и U1932165) и Фондом естественных наук провинции Гуандун, Китай (номер гранта 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
Riferimenti
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
- Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
- Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
- Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
- Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
- Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Jung, J. -. W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
- Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
- Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
- Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
- Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
- Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
- Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
- Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
- Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
- Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
- Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
- Wei, M. -. T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
- Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
- Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
- Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
- Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).
