Medición de la compresibilidad de célula y núcleo basada en microdispositivo acustofluídico
Summary
Aquí se presenta un protocolo para construir un sistema rápido y no destructivo para medir la compresibilidad de células o núcleos basado en microdispositivos acustofluídicos. Se investigaron los cambios en las propiedades mecánicas de las células tumorales después de la transición epitelial-mesenquimal o la radiación ionizante, lo que demuestra la perspectiva de aplicación de este método en la investigación científica y la práctica clínica.
Abstract
La mecánica celular juega un papel importante en la metástasis tumoral, la transformación maligna de las células y la radiosensibilidad. Durante estos procesos, estudiar las propiedades mecánicas de las células es a menudo un desafío. Los métodos de medición convencionales basados en el contacto, como la compresión o el estiramiento, son propensos a causar daño celular, lo que afecta la precisión de la medición y el cultivo celular posterior. Las mediciones en estado adherente también pueden afectar la precisión, especialmente después de la irradiación, ya que la radiación ionizante aplanará las células y mejorará la adhesión. Aquí, se ha desarrollado un sistema de medición de mecánica celular basado en el método acustofluídico. La compresibilidad celular se puede obtener registrando la trayectoria de movimiento de la celda bajo la acción de la fuerza acústica, que puede realizar mediciones rápidas y no destructivas en estado suspendido. Este documento informa en detalle los protocolos para el diseño de chips, preparación de muestras, registro de trayectoria, extracción de parámetros y análisis. La compresibilidad de diferentes tipos de células tumorales se midió con base en este método. La medición de la compresibilidad del núcleo también se logró ajustando la frecuencia de resonancia de la cerámica piezoeléctrica y el ancho del microcanal. Combinado con la verificación a nivel molecular de los experimentos de inmunofluorescencia, se comparó la compresibilidad celular antes y después de la transición epitelial a mesenquimal inducida por fármacos (EMT). Además, se reveló el cambio de compresibilidad celular después de la irradiación de rayos X con diferentes dosis. El método de medición de la mecánica celular propuesto en este documento es universal y flexible y tiene amplias perspectivas de aplicación en la investigación científica y la práctica clínica.
Introduction
Las propiedades mecánicas celulares juegan un papel importante en la metástasis tumoral, la transformación maligna de las células y la radiosensibilidad 1,2. Para obtener una comprensión profunda del papel de las propiedades mecánicas celulares en el proceso anterior, la medición precisa de la mecánica celular es crítica, y la medición no debe causar daño a las células para su posterior cultivo y análisis. El proceso de medición debe ser lo más rápido posible, de lo contrario, la viabilidad celular puede verse afectada si las células se eliminan del entorno de cultivo durante mucho tiempo.
Los métodos de medición de mecánica celular existentes enfrentan algunas limitaciones. Algunos métodos, como la citometría de torsión magnética, las pinzas magnéticas y la microrreología de seguimiento de partículas, causan daño celular debido a la introducción de partículas en las células 3,4,5. Los métodos que miden por contacto con células, como el microscopio de fuerza atómica (AFM), la aspiración de micropipetas, la microconstricción y la técnica de placa paralela, también son propensos al daño celular y el rendimiento es difícil de aumentar 6,7,8. Además, la radiación ionizante aplanará las células y aumentará su adhesión9; Por lo tanto, es necesario medir la mecánica celular completa en suspensión.
En respuesta a los desafíos anteriores, se ha desarrollado un sistema de medición de mecánica celular basado en el método acustofluídico 10,11,12,13,14. El ancho del canal se adapta a la media longitud de onda acústica, creando así un nodo de onda estacionaria en la línea media del microcanal. Bajo la acción de la fuerza de radiación acústica, las células o perlas estándar pueden moverse al nodo de presión acústica. Dado que se conocen las propiedades físicas de las perlas estándar (tamaño, densidad y compresibilidad), se puede determinar la densidad de energía acústica. Luego, la compresibilidad celular se puede obtener registrando las trayectorias de movimiento de las células en el campo acústico. Se puede lograr una medición no destructiva de alto rendimiento de células en estado de suspensión. Este documento presentará el diseño del chip microfluídico, el establecimiento del sistema y los pasos de medición. Se ha llevado a cabo la medición de varios tipos de células tumorales para verificar la precisión del método. El ámbito de aplicación de este método se había extendido a estructuras subcelulares (como el núcleo) ajustando la frecuencia de resonancia de la cerámica piezoeléctrica y el ancho del microcanal. Además, se investigaron los cambios en la compresibilidad celular después de la EMT inducida por fármacos o la irradiación de rayos X con diferentes dosis. Los resultados demuestran la amplia aplicabilidad de este método como una poderosa herramienta para estudiar la correlación entre los cambios bioquímicos y las propiedades mecánicas celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos de medición de mecánica celular comúnmente utilizados son AFM, aspiración de micropipetas, métodos microfluídicos, técnica de placa paralela, pinzas ópticas, camilla óptica y métodos acústicos20. Los métodos de microfluídica pueden funcionar con tres enfoques: microconstricción, flujo extensional y flujo de corte. Entre ellos, la camilla óptica, las pinzas ópticas, los métodos acústicos, el flujo extensional y los enfoques de flujo cortante son mediciones sin contact…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 12075330 y U1932165) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (número de subvención 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
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