Mätning av kompressibiliteten hos cell och kärna baserat på akustofluidisk mikroenhet
Summary
Här presenteras ett protokoll för att bygga ett snabbt och icke-destruktivt system för mätning av cell- eller kärnkompressibilitet baserat på akustofluidisk mikroenhet. Förändringar i mekaniska egenskaper hos tumörceller efter epitel-mesenkymal övergång eller joniserande strålning undersöktes, vilket visar tillämpningsutsikterna för denna metod i vetenskaplig forskning och klinisk praxis.
Abstract
Cellmekanik spelar en viktig roll vid tumörmetastaser, malign omvandling av celler och radiokänslighet. Under dessa processer är det ofta utmanande att studera cellernas mekaniska egenskaper. Konventionella mätmetoder baserade på kontakt såsom kompression eller sträckning är benägna att orsaka cellskador, vilket påverkar mätnoggrannheten och efterföljande cellodling. Mätningar i vidhäftande tillstånd kan också påverka noggrannheten, särskilt efter bestrålning eftersom joniserande strålning kommer att platta ut celler och förbättra vidhäftningen. Här har ett cellmekaniskt mätsystem baserat på akustofluidisk metod utvecklats. Cellkompressibiliteten kan erhållas genom att registrera cellrörelsebanan under verkan av den akustiska kraften, som kan realisera snabb och icke-destruktiv mätning i suspenderat tillstånd. Detta dokument rapporterar i detalj protokollen för chipdesign, provberedning, banregistrering, parameterutvinning och analys. Kompressibiliteten hos olika typer av tumörceller mättes baserat på denna metod. Mätning av kärnans kompressibilitet uppnåddes också genom att justera resonansfrekvensen för den piezoelektriska keramiken och mikrokanalens bredd. I kombination med verifieringen på molekylär nivå av immunofluorescensexperiment jämfördes cellkompressibiliteten före och efter läkemedelsinducerad epitelial till mesenkymal övergång (EMT). Vidare avslöjades förändringen av cellkompressibilitet efter röntgenbestrålning med olika doser. Den cellmekaniska mätmetoden som föreslås i denna uppsats är universell och flexibel och har breda tillämpningsutsikter inom vetenskaplig forskning och klinisk praxis.
Introduction
Cellmekaniska egenskaper spelar en viktig roll vid tumörmetastaser, malign omvandling av celler och radiokänslighet 1,2. För att få en fördjupad förståelse för rollen av cellmekaniska egenskaper i ovanstående process är noggrann mätning av cellulär mekanik kritisk, och mätningen bör inte orsaka skador på cellerna för efterföljande odling och analys. Mätprocessen bör vara så snabb som möjligt, annars kan cellviabiliteten påverkas om celler avlägsnas från odlingsmiljön under lång tid.
Befintliga cellmekaniska mätmetoder står inför vissa begränsningar. Vissa metoder, såsom magnetisk vridcytometri, magnetisk pincett och partikelspårningsmikrorheologi, orsakar cellskador på grund av införandet av partiklar i cellerna 3,4,5. Metoder som mäter genom kontakt med celler, såsom atomkraftmikroskop (AFM), mikropipettaspiration, mikroförträngning och parallellplattteknik, är också benägna att cellskador och genomströmningen är svår att öka 6,7,8. Dessutom kommer joniserande strålning att platta ut celler och öka deras vidhäftning9; Det är därför nödvändigt att mäta hela cellmekaniken i suspension.
Som svar på ovanstående utmaningar har ett cellmekaniskt mätsystem baserat på akustofluidisk metod 10,11,12,13,14 utvecklats. Kanalbredden matchas med den akustiska halvvåglängden, vilket skapar en stående vågnod vid mikrokanalens mittlinje. Under verkan av akustisk strålningskraft kan cellerna eller standardpärlorna flytta till den akustiska trycknoden. Eftersom de fysikaliska egenskaperna hos standardpärlorna (storlek, densitet och kompressibilitet) är kända kan den akustiska energitätheten bestämmas. Därefter kan cellkompressibiliteten erhållas genom att registrera cellernas rörelsebanor i det akustiska fältet. Icke-destruktiv mätning med hög genomströmning av celler i suspensionstillstånd kan uppnås. Detta dokument kommer att introducera utformningen av det mikrofluidiska chipet, upprättandet av systemet och mätstegen. Mätning av olika typer av tumörceller har utförts för att verifiera metodens noggrannhet. Tillämpningsområdet för denna metod hade utvidgats till subcellulära strukturer (såsom kärna) genom att justera resonansfrekvensen för den piezoelektriska keramiken och mikrokanalens bredd. Dessutom undersöktes förändringarna i cellkompressibilitet efter läkemedelsinducerad EMT eller röntgenbestrålning med olika doser. Resultaten visar den breda tillämpbarheten av denna metod som ett kraftfullt verktyg för att studera korrelationen mellan biokemiska förändringar och cellulära mekaniska egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanliga cellmekaniska mätmetoder är AFM, mikropipettaspiration, mikrofluidikmetoder, parallellplatteteknik, optisk pincett, optisk bår och akustiska metoder20. Mikrofluidikmetoder kan fungera med tre tillvägagångssätt: mikroförträngning, förlängningsflöde och skjuvflöde. Bland dem är optisk bår, optisk pincett, akustiska metoder, förlängningsflöde och skjuvflödesmetoder beröringsfria mätningar. Till skillnad från kontaktmätningar kan beröringsfria mätningar effektivt undvik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 12075330 och U1932165) och Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (bidragsnummer 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
Riferimenti
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
- Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
- Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
- Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
- Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
- Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Jung, J. -. W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
- Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
- Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
- Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
- Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
- Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
- Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
- Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
- Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
- Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
- Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
- Wei, M. -. T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
- Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
- Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
- Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
- Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).
