Uppskattning av utbytet av föreningar på TLC-plattan via Blue-LED-belysningstekniken
Summary
Detta protokoll utvecklade en metod för att uppskatta utbytet av föreningar på TLC-plattan med hjälp av blå-LED-belysningstekniken. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är att det är säkert, effektivt, billigt och gör det möjligt för forskaren att mäta flera prover samtidigt.
Abstract
Tunnskiktskromatografi (TLC) är en tillgänglig analytisk teknik som har använts i stor utsträckning inom organisk kemiforskning för att kvantifiera utbytet av okända prover. Den aktuella studien utvecklade en effektiv, billig och säker metod för att uppskatta utbytet av prover på en TLC-platta med hjälp av blå-LED-belysningen. Lovastatin extraherat från Aspergillus terreus var exempelföreningen som användes i den aktuella studien. Regressionsmodeller baserade på lovastatinstandarden användes för att utvärdera utbytet av lovastatin. Tre metoder jämfördes: bioassay, UV-detektion och blå-LED-belysning. Resultatet visade att blå-LED-belysningsmetoden är betydligt mer tidseffektiv än UV-detektion och bioassay-metoder. Dessutom, blå-LED-belysningen var ett relativt säkert alternativ på grund av oro för biologiska faror i bioassay-metoden (t.ex. mikrobiell infektion) och ultraviolett exponering i UV-detektionsmetoden. Jämfört med de dyra metoderna som kräver specialiserade instrument och långsiktig träning innan de arbetar självständigt, såsom GC, HPLC och HPTLC, var användning av blå-LED-belysningen ett ekonomiskt alternativ för att uppskatta utbytet av prover från en TLC-platta.
Introduction
Tunnskiktskromatografi (TLC) används ofta som en kvalitativ och kvantitativ teknik inom organisk kemi 1,2,3. De främsta fördelarna med TLC är att det ger snabb detektering, flexibla provkrav och inte kräver specialutrustning4. Hittills, även om många avancerade tillvägagångssätt har etablerats, är TLC fortfarande den viktigaste metoden för att identifiera okända prover i en blandning. Utmaningen med detta tillvägagångssätt är dock bristen på säker och billig utrustning för att kvantifiera provutbytet, särskilt för att utveckla laboratorier med begränsade budgetar. Den aktuella studien syftade därför till att utveckla en effektiv, säker och billig metod i kombination med TLC för att uppskatta utbytet av proverna.
Till skillnad från högpresterande TLC (HPTLC), högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och gaskromatografi (GC) med strikta provkrav, tidskrävande och involvering av flersteg för provberedning1,5, visade TLC flera fördelar. För det första, för provberedning, kan HPLC och GC inte detektera råextraktet eftersom råextraktet kan ansluta kolonnen för HPLC och GC. För det andra, när proverna inte är UV-lämpliga (viktiga för HPLC-analys) eller med låg flyktighet (viktigt för GC-analys), kan TLC appliceras på dessa prover, och användningen av visualiseringsreagens gör de isolerade proverna synliga på tunna lager 6,7,8. För det tredje, för allmänna användare, kräver HPLC och GC i allmänhet en relativt lång tid före träning innan de arbetar självständigt, jämfört med TLC. Dessutom kan kvantitativ TLC-analys, känd som högpresterande TLC (HPTLC), digitalisera informationen på en TLC-platta med en mycket känslig skanner. Kostnaden för HPTLC-systemet är dock relativt dyr. Som sådan är det viktigt att utveckla ett kostnadseffektivt och snabbt tillvägagångssätt för att kvantifiera prover på TLC-plattan.
Liknande metoder har utvecklats för kvantifiering av TLC-avkastning; till exempel rapporterade Johnson9 en teknik som gör det möjligt att kvantifiera proverna på en TLC-platta med hjälp av en flatbäddsskanner ansluten till en dator. År 2001 utvecklade El-Gindy et al.10 den TLC-densitometriska metoden, som användes för att detektera föreningen med optisk densitet, och tekniken tillämpades också av Elkady et al.11. År 2007 presenterade Hess2 den digitalt förbättrade TLC-metoden (DE-TLC) som används för att detektera utbytet av en förening på en TLC-platta med hjälp av en digitalkamera i kombination med UV-ljus. Hess jämförde också kostnadsskillnaderna mellan HPTLC och DE-TLC-metoden och drog slutsatsen att DE-TLC-metoden kunde användas i gymnasie- och högskolelaboratorier på grund av dess överkomliga kostnad2. Kostnaden för TLC-densitometrisk metod var dock fortfarande dyr, och driften av ultraviolett ljus kräver adekvat förutbildning om användarna kan utsättas för ultraviolett strålning. Därför, kompatibel med TLC, är det önskvärt att utveckla en effektiv, säker och billig metod för att kvantifiera provutbytet.
Den aktuella studien beskrev ett protokoll för att detektera provet på en TLC-platta med hjälp av blå-LED-belysningen och utvecklade en regressionsmodell med hög tillförlitlighet (högt R-kvadratvärde) för att mäta bandens dimensioner och sedan bestämma föreningsutbytet. Slutligen konstaterades att den blå LED-belysningsmetoden är en relativt säker (vs. UV-detektionsmetod), billig (vs. GC, HPLC och HPTLC) och effektiv (jämfört med bioassay-metod) metod för avkastningskvantifiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuella studien beskrev ett nytt tillvägagångssätt, blå-LED-belysningen, för att kvantifiera föreningar utan att använda dyr och specialiserad utrustning, såsom HPTLC, HPLC och GC-metoden, och metoden jämfördes med bioassay och UV-detekterade metoder för att utvärdera kvantifieringsprestanda. Som ett resultat drogs slutsatsen att blå-LED-belysningsmetoden är ett relativt säkert och effektivt protokoll som används för att kvantifiera utbytet av riktade föreningar på TLC-plattan.
<p class="jove_…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
Riferimenti
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography – Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen, ., Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography – Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
