Sintesi proteica priva di cellule da estratti cellulari carenti di esonucleasi utilizzando modelli di DNA lineare

Mahnaz Sabeti Azad; Angelo Cardoso Batista; Jean-Loup Faulon; Chase L. Beisel; Jerome Bonnet; Manish Kushwaha

doi:10.3791/64236

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Articolo metodologico

Sintesi proteica priva di cellule da estratti cellulari carenti di esonucleasi utilizzando modelli di DNA lineare

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DOI:

10.3791/64236

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9 agosto 2022

Mahnaz Sabeti Azad^*¹ , Angelo Cardoso Batista^*¹ , Jean-Loup Faulon¹ , Chase L. Beisel²^,³ , Jerome Bonnet⁴ , Manish Kushwaha¹

¹INRAe, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, ²Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI), ³Medical Faculty, University of Würzburg, ⁴Centre de Biochimie Structurale, INSERM U1054, CNRS UMR 5048, University of Montpellier

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentato qui un protocollo per la preparazione e la calibrazione tampone di estratti cellulari da ceppi knockout di esonucleasi V di Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Questo è un approccio rapido, facile e diretto per l'espressione in sistemi di sintesi proteica privi di cellule utilizzando modelli lineari di DNA.

Abstract

La sintesi proteica priva di cellule (CFPS) è recentemente diventata molto popolare nel campo della biologia sintetica grazie ai suoi numerosi vantaggi. L'utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS consentirà inoltre alla tecnologia di raggiungere il suo pieno potenziale, riducendo il tempo sperimentale eliminando le fasi di clonazione, trasformazione ed estrazione del plasmide. Il DNA lineare può essere rapidamente e facilmente amplificato mediante PCR per ottenere alte concentrazioni del modello, evitando potenziali tossicità di espressione in vivo . Tuttavia, i modelli lineari di DNA sono rapidamente degradati dalle esonucleasi che sono naturalmente presenti negli estratti cellulari. Ci sono diverse strategie che sono state proposte per affrontare questo problema, come l'aggiunta di inibitori della nucleasi o la modifica chimica delle estremità lineari del DNA per la protezione. Tutte queste strategie costano tempo e risorse extra e devono ancora ottenere livelli di espressione proteica vicini al plasmide. Un protocollo dettagliato per una strategia alternativa è presentato qui per l'utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS. Utilizzando estratti cellulari da cellule knockout carenti di esonucleasi, i modelli lineari di DNA rimangono intatti senza richiedere alcuna modifica finale. Presentiamo le fasi di preparazione del lisato cellulare da Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD ceppo mediante lisi sonicazione e calibrazione tampone per Mg-glutammato (Mg-glu) e K-glutammato (K-glu) specificamente per DNA lineare. Questo metodo è in grado di raggiungere livelli di espressione proteica paragonabili a quelli del DNA plasmidico in E. coli CFPS.

Introduzione

I sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) sono sempre più utilizzati come metodo rapido, semplice ed efficiente per l'ingegneria dei biosensori, la produzione decentralizzata e la prototipazione di circuiti genetici¹. Grazie al loro grande potenziale, i sistemi CFPS sono utilizzati regolarmente nel campo della biologia sintetica. Tuttavia, finora i sistemi CFPS si basano su plasmidi circolari che possono limitare la tecnologia dal raggiungere il suo pieno potenziale. La preparazione del DNA plasmidico dipende da molti passaggi che richiedono molto tempo durante la clonazione e grandi quantità di isolamento del DNA. D'altra parte, l'....