Cellefri proteinsyntese fra exonuklease-mangelfulde cellulære ekstrakter ved hjælp af lineære DNA-skabeloner
Summary
Her præsenteres en protokol til fremstilling og bufferkalibrering af celleekstrakter fra exonuklease V knockout-stammer af Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD og ΔrecB). Dette er en hurtig, nem og direkte tilgang til ekspression i cellefrie proteinsyntesesystemer ved hjælp af lineære DNA-skabeloner.
Abstract
Cellefri proteinsyntese (CFPS) er for nylig blevet meget populær inden for syntetisk biologi på grund af dens mange fordele. Brug af lineære DNA-skabeloner til CFPS vil yderligere gøre det muligt for teknologien at nå sit fulde potentiale, hvilket reducerer den eksperimentelle tid ved at eliminere trinene til kloning, transformation og plasmidekstraktion. Lineært DNA kan hurtigt og let forstærkes af PCR for at opnå høje koncentrationer af skabelonen, hvilket undgår potentiel in vivo-ekspressionstoksicitet. Imidlertid nedbrydes lineære DNA-skabeloner hurtigt af exonukleaser, der er naturligt til stede i celleekstrakterne. Der er flere strategier, der er blevet foreslået for at tackle dette problem, såsom tilføjelse af nukleasehæmmere eller kemisk modifikation af lineære DNA-ender til beskyttelse. Alle disse strategier koster ekstra tid og ressourcer og har endnu ikke opnået næsten plasmidniveauer af proteinekspression. En detaljeret protokol for en alternativ strategi præsenteres her for brug af lineære DNA-skabeloner til CFPS. Ved at bruge celleekstrakter fra exonuklease-mangelfulde knockout-celler forbliver lineære DNA-skabeloner intakte uden at kræve nogen slutmodifikationer. Vi præsenterer forberedelsestrinnene for cellelysat fra Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stamme ved sonikeringslysis og bufferkalibrering for Mg-glutamat (Mg-glu) og K-glutamat (K-glu) specifikt til lineært DNA. Denne metode er i stand til at opnå proteinekspressionsniveauer, der kan sammenlignes med det fra plasmid-DNA i E. coli CFPS.
Introduction
Cellefri proteinsyntese (CFPS) systemer bruges i stigende grad som en hurtig, enkel og effektiv metode til biosensorteknik, decentraliseret fremstilling og prototyping af genetiske kredsløb1. På grund af deres store potentiale anvendes CFPS-systemer regelmæssigt inden for syntetisk biologi. Indtil videre er CFPS-systemer imidlertid afhængige af cirkulære plasmider, der kan begrænse teknologien fra at nå sit fulde potentiale. Forberedelse af plasmid-DNA afhænger af mange tidskrævende trin under kloning og store mængder DNA-isolering. På den anden side kan PCR-amplifikation fra et plasmid eller en syntetiseret DNA-skabelon bruges til blot at forberede CFPS-skabeloner inden for få timer 2,3. Derfor tilbyder anvendelse af lineært DNA en lovende løsning til CFPS. Imidlertid nedbrydes lineært DNA hurtigt af exonukleaser, der er naturligt til stede i cellulære ekstrakter4. Der er løsninger, der løser dette problem, såsom at bruge λ-GamS-protein5 eller DNA indeholdende Chi-steder6 som beskyttelsesmidler eller direkte beskytte det lineære DNA ved kemisk modifikation af dets ender 2,7,8,9. Alle disse metoder kræver tilskud til celleekstraktet, som er dyre og tidskrævende. Det har været kendt i lang tid, at exonuklease V-komplekset (RecBCD) nedbryder lineært DNA icellelysater 4. For nylig viste vi, at lineært DNA kan beskyttes meget bedre i lysater fra celler, der er slået ud for exonukleasegener (recBCD)10.
I denne protokol beskrives trin til fremstilling af cellefrie lysater fra E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stammen ved sonikeringslyse detaljeret. Sonikeringslysis er en almindelig og overkommelig teknik, der anvendes af flere laboratorier11,12. De ekstrakter, der fremstilles af denne stamme, behøver ikke tilføjelse af ekstra komponent- eller DNA-skabelonmodifikation for at understøtte ekspression fra lineære DNA-skabeloner. Metoden er afhængig af det væsentlige trin i bufferoptimering for celleekstrakter specifikt til lineær DNA-ekspression fra indfødte E. coli-promotorer. Det har vist sig, at denne specifikke bufferoptimering til lineær DNA-ekspression er nøglen for indfødte σ70-promotorer til at give høj proteinproduktion uden GamS-protein eller Chi DNA-tilskud, selv undgå oprensning af PCR-produkterne10. Den optimale koncentration af Mg-glu til lineær DNA-ekspression viste sig at svare til den for plasmid-DNA. Den optimale koncentration af K-glu viste imidlertid en væsentlig forskel mellem lineært og plasmid-DNA, sandsynligvis på grund af en transkriptionsrelateret mekanisme10. Funktionaliteten af proteiner udtrykt ved hjælp af denne metode er blevet demonstreret til flere anvendelser, såsom hurtig screening af tåholdsafbrydere og aktivitetsvurdering af enzymvarianter10.
Denne protokol giver en enkel, effektiv og omkostningseffektiv løsning til brug af lineære DNA-skabeloner i E. coli-cellefrie systemer ved blot at bruge mutante ΔrecBCD-celleekstrakter og specifik kalibrering til lineært DNA som skabelon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi, at cellelysat fremstillet af E. coli BL21 Rosetta2 med en genomisk knockout til enten recB eller recBCD operon understøtter højt proteinekspression fra lineære DNA-skabeloner. Denne protokol uddyber en trin-for-trin lysatkalibreringsprocedure, der er specifik for lineære DNA-skabeloner (figur 2), som er et kritisk trin, der fører til det høje udtryk fra σ70-promotorer i lineært DNA og når næsten plasmidniveauer for ækvimolære DNA-koncentra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB og JLF anerkender finansieringsstøtte fra ANR SINAPUV-tilskuddet (ANR-17-CE07-0046). JLF og JB anerkender finansieringsstøtte fra ANR SynBioDiag-tilskuddet (ANR-18-CE33-0015). MSA og JLF anerkender finansieringsstøtte fra ANR iCFree-tilskuddet (ANR-20-BiopNSE). JB anerkender støtte fra EFR, der starter “COMPUCELL” (tilskudsnummer 657579). Centre de Biochimie Structurale anerkender støtte fra den franske infrastruktur for integreret strukturbiologi (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK anerkender finansieringsstøtte fra INRAe’s MICA-afdeling, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) regionens DIM-RFSI og ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Dette arbejde blev støttet af finansiering gennem European Research Council Consolidator Award (865973 til CLB).
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
Riferimenti
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
