Method Article

Quantificazione della caspasi-9 immunocolorata nel tessuto retinico

DOI:

10.3791/64237

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July 25th, 2022

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1Department of Pathology & Cell Biology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3NCI-designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 4Department of Neurology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 5The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University

In This Article

Summary

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Qui è presentato un protocollo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi.

Abstract

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La famiglia delle caspasi è nota per mediare molti percorsi cellulari oltre la morte cellulare, tra cui la differenziazione cellulare, il pathfinding assonale e la proliferazione. Dall'identificazione della famiglia delle proteasi di morte cellulare, c'è stata una ricerca di strumenti per identificare ed espandere la funzione di specifici membri della famiglia negli stati di sviluppo, salute e malattia. Tuttavia, molti degli strumenti di caspasi attualmente disponibili in commercio che sono ampiamente utilizzati non sono specifici per la caspasi mirata. In questo rapporto, delineiamo l'approccio che abbiamo utilizzato per identificare, convalidare e indirizzare la caspasi-9 nel sistema nervoso utilizzando un nuovo inibitore e approcci genetici con letture immunoistochimiche. In particolare, abbiamo utilizzato il tessuto neuronale retinico come modello per identificare e convalidare la presenza e la funzione delle caspasi. Questo approccio consente l'interrogazione delle funzioni apoptotiche e non apoptotiche specifiche della caspasi-9 del tipo cellulare e può essere applicato ad altri tessuti complessi e caspasi di interesse. Comprendere le funzioni delle caspasi può aiutare ad ampliare le attuali conoscenze in biologia cellulare e può anche essere vantaggioso per identificare potenziali bersagli terapeutici a causa del loro coinvolgimento nella malattia.

Introduction

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Le caspasi sono una famiglia di proteasi che regolano la morte cellulare dello sviluppo, le risposte immunitarie e la morte cellulare aberrante nella malattia 1,2. Mentre è ben noto che i membri della famiglia delle caspasi sono indotti in una varietà di malattie neurodegenerative, capire quale caspasi guida la patologia della malattia è più difficile3. Tali studi richiedono strumenti per identificare, caratterizzare e convalidare la funzione dei singoli membri della famiglia delle caspasi. L'analisi delle singole caspasi rilevanti è importante sia da un punto di vista meccanicistico ch....

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Protocol

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Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.

1. Preparazione del tessuto retinico e criosezione

  1. Eutanasia degli animali mediante somministrazione di anestesia intraperitoneale (ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)), e perfondere i topi sottoposti a RVO (vedi8 per i dettagli) con paraformaldeide al 4% (PFA) usando una pom....

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Results

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Il protocollo descritto consente all'utente di analizzare e quantificare i livelli di caspasi-9 nel tessuto retinico. Inoltre, presenta strumenti per identificare ulteriormente, convalidare e indirizzare specificamente la caspasi-9 e i substrati a valle. I passaggi riassunti consentono un'analisi quantificabile dei livelli di caspasi e della specificità cellulare nelle fotomicrografie fluorescenti. Tutte le cifre mostrano fotomicrografie rappresentative e quantificazione dei livelli di caspasi indicati nella retina total.......

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Discussion

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Le caspasi sono una famiglia multi-membro di proteasi meglio studiata per i loro ruoli nella morte cellulare e nell'infiammazione; Tuttavia, più recentemente sono state scoperte una varietà di funzioni non di morte per alcuni membri della famiglia 4,5. Gran parte della nostra comprensione della funzione delle caspasi deriva dal lavoro sulla coltura cellulare e dai dati inferenziali delle malattie umane. Mentre è apprezzato che vi sia un'induzione, attivazione o i.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano i seguenti interessi concorrenti: C.M.T. ha le seguenti domande di brevetto US20200164026, US20190142915 e US20150165061. C.M.T. e S.S. hanno una domanda di brevetto US 20140024597. C.M.T., A.M.P. e M.I.A. hanno una domanda di brevetto US2020058683. C.M.T. e Y.Y.J. hanno una domanda di brevetto WO2018013519. M.I.A e CMT sono elencati come inventori su una domanda di brevetto WO / 2020 / 223212 dagli amministratori della Columbia University nella città di New York. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 e dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) del National Institutes of Health (NIH), numero di premio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (a CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT), e il Dipartimento della Difesa Esercito/Aeronautica (da DURIP a CMT).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Caspasi-7 488Novus BiologicalsNB-56529AF488uso a 1:150
anti-cl-Caspasi-9Segnalazione cellulare9505-Suso a 1:800
anti-CD31BD Pharmingen553370uso a 1:50
Microscopio a disco rotante confocaleBiovision
FIJI 2.3.0open source
Fluormount GFisher50-187-88
PinzaRobozRS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 topigeneratiin laboratorio vedi Avrutsky 2020
Isolectina (594, 649)VectorDL-1207uso a 1:200
Ketamina cloridratoHenry ScheinNDC: 11695-0702-1
Pompa di perfusione Masterflex
Pen1-XBir3generatoin laboratorio vedi Avrutsky 2020
Prism 9.1GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.Fisher14-373-65
Vis-a-View 4.0Visitron Systems
XilazinaAkornNDCL 59399-110-20

References

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  1. Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
  2. Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
  3. Troy, C. M., Jean, Y. Y.

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Tags

Caspase 9 QuantificationRetinal TissueImmunohistochemistryConfocal MicroscopyRetinal Vein OcclusionVascular MarkerNeuronal Caspase ExpressionCell Type SpecificityWestern BlottingApoptotic Pathways

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