כימות של Caspase-9 מוכתם חיסונית ברקמת הרשתית
Summary
מוצג כאן פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה מפורט כדי לזהות, לאמת ולמקד קספאזות רלוונטיות מבחינה תפקודית ברקמות מורכבות.
Abstract
ידוע כי משפחת הקספאזות מתווכת מסלולים תאיים רבים מעבר למוות תאי, כולל התמיינות תאים, איתור נתיבים אקסונאליים והתפשטות. מאז זיהוי משפחת הפרוטאזות של מוות תאי, קיים חיפוש אחר כלים לזיהוי והרחבת תפקודם של בני משפחה ספציפיים במצבי התפתחות, בריאות וחולי. עם זאת, רבים מכלי הקספאזה הזמינים כיום באופן מסחרי, הנמצאים בשימוש נרחב, אינם ספציפיים לקספאזה הממוקדת. בדו”ח זה אנו מפרטים את הגישה שבה השתמשנו כדי לזהות, לאמת ולמקד את caspase-9 במערכת העצבים באמצעות מעכב חדשני וגישות גנטיות עם קריאות אימונוהיסטוכימיות. באופן ספציפי, השתמשנו ברקמה העצבית ברשתית כמודל כדי לזהות ולאמת את נוכחותם ותפקודם של קספאזות. גישה זו מאפשרת לחקור תפקודים ספציפיים של קספאז-9 אפופטוטיים ולא-אפופטוטיים מסוג התא, וניתן ליישם אותה על רקמות מורכבות אחרות ועל קספאזות מעניינות. הבנת התפקודים של קספאזות יכולה לסייע בהרחבת הידע הקיים בביולוגיה של התא, ויכולה גם להיות יתרון בזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות בשל מעורבותן במחלות.
Introduction
הקספאזות הן משפחה של פרוטאזות המווסתות מוות התפתחותי של תאים, תגובות חיסוניות ומוות תאי סוטה במחלה 1,2. אמנם ידוע כי בני משפחת הקספאזה מושרים במגוון מחלות נוירודגנרטיביות, אך ההבנה איזה קספאז מניע פתולוגיה של מחלות מאתגרת יותר3. מחקרים כאלה דורשים כלים כדי לזהות, לאפיין ולאמת את תפקודם של בני משפחה קספאזיים בודדים. ניתוח הקספאזות האינדיבידואליות הרלוונטיות חשוב הן מבחינה מכניסטית והן מבחינה טיפולית, שכן בספרות יש מחקרים רבים המספקים עדות לתפקידים המגוונים של caspases 4,5. לכן, אם המטרה היא למקד קספאז במחלה לתועלת טיפולית, זה קריטי שיהיה מיקוד ספציפי של בני המשפחה הרלוונטיים. טכניקות מסורתיות לזיהוי רמות קספאז ברקמה כוללות כתם מערבי וגישות אנזימטיות ופלואורומטריות 3,6. עם זאת, אף אחד מהאמצעים הללו אינו מאפשר זיהוי ספציפי לתאים של רמות קספאזה, ובתרחישים מסוימים, לעתים קרובות לא ניתן לזהות קספאזות מבוקעות על ידי אמצעי ניתוח חלבונים מסורתיים. ידוע כי קספאזות יכולות למלא תפקידים אפופטוטיים ולא אפופטוטיים שונים באותה רקמה7, ולכן יש צורך באפיון זהיר של רמות הקספאז הספציפיות לתאים להבנה מדויקת של מסלולי התפתחות ומחלות.
מחקר זה מראה הפעלה ותפקוד של קספאז במודל של היפוקסיה-איסכמיה נוירו-וסקולרית – חסימת ורידים ברשתית (RVO)7,8. ברקמה מורכבת כמו הרשתית, ישנם מספר סוגי תאים שיכולים להיות מושפעים מההיפוקסיה-איסכמיה המושרה ב-RVO, כולל תאי גלייה, נוירונים וכלי דם7. ברשתית העכבר הבוגרת, יש מעט מאוד ביטוי של קספאזות הניכר ברקמה בריאה, כפי שנמדד על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC)7, אך זה לא המקרה במהלך התפתחות9 או במודלים של מחלת רשתית10,11. IHC היא טכניקה המבוססת היטב במחקר ביו-רפואי ואפשרה אימות של מחלות ומטרות פתולוגיות, זיהוי תפקידים חדשים באמצעות לוקליזציה מרחבית וכימות של חלבונים. במקרים בהם לא ניתן לזהות תוצרי קספאז שסועים על ידי כתם מערבי או ניתוח פלואורומטרי, וגם לא את מיקום התא הספציפי של קספאזות נפרדות או חקירה של מסלולי איתות קספאז באמצעות לוקליזציה, יש להשתמש ב- IHC.
על מנת לקבוע את הקספאזות הרלוונטיות מבחינה תפקודית ב-RVO, IHC שימש עם נוגדנים מאומתים עבור קספאזות וסמנים תאיים. המחקרים הקודמים שבוצעו במעבדה הראו כי caspase-9 הופעל במהירות במודל של שבץ איסכמי ועיכוב של caspase-9 עם מעכב ספציפי מאוד מוגן מפני תפקוד לקוי של נוירונים ומוות12. מכיוון שהרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית (CNS), היא משמשת כמערכת מודל לחקירה וחקירה נוספת של תפקידו של קספאז-9 בפציעות נוירו-וסקולריות13. לשם כך, נעשה שימוש במודל העכבר של RVO כדי לחקור את המיקום וההתפלגות הספציפיים לתא של caspase-9 ואת משמעותו בפגיעה נוירו-וסקולרית. RVO הוא גורם נפוץ לעיוורון בקרב מבוגרים עובדים הנובע מפגיעה בכלי הדם14. נמצא כי קספאז-9 התבטא באופן לא אפופטוטי בתאי אנדותל, אך לא בתאי עצב.
כרקמה, הרשתית יש את היתרון של להיות חזותית כמו שטוח, אשר מאפשר הערכה של רשתות כלי הדם, או כמו חתכים, אשר מדגיש את שכבות הרשתית העצבית. כימות ביטוי חלבון הקספאזה בחתכים מספק הקשר, לגביו קספאז עשוי להיות קריטי בקישוריות העצבית ברשתית ובתפקוד הראייה על ידי זיהוי לוקליזציה של הקספאזה ברשתית. לאחר זיהוי ואימות, מיקוד של caspase של עניין מושגת באמצעות מחיקה ספציפית לתא inducible של caspase מזוהה. עבור פניות טיפוליות פוטנציאליות, הרלוונטיות של הקספאזות המעניינות נבדקה באמצעות כלים ספציפיים כדי לעכב את הקספאזה המופעלת. עבור caspase-9 תא היה מעכב סלקטיבי מאוד 7,15, Pen1-XBIR3 שימש. לצורך דו”ח זה, נעשה שימוש בזן C57BL/6J זכרי בן חודשיים ובזן נוקאאוט אנדותל קספאז-9 הניתן לטמוקסיפן (iEC Casp9KO) עם רקע C57BL/6J. בעלי חיים אלה נחשפו למודל העכבר של RVO ו-C57BL/6J טופלו במעכב הסלקטיבי קספאז-9, Pen1-XBir3. ניתן ליישם את המתודולוגיה המתוארת על מודלים אחרים של מחלות במערכות המרכזיות וההיקפיות 7,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
קספזות הן משפחה מרובת חברים של פרוטאזות הנחקרות בצורה הטובה ביותר בשל תפקידן במוות של תאים ובדלקת; עם זאת, לאחרונה נחשפו מגוון פונקציות שאינן מוות עבור חלק מבני המשפחה 4,5. חלק גדול מהבנתנו את תפקוד הקספאז נגזר מעבודה בתרבית תאים ומנתונים הסקה ממחלות אנושיות…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית עמיתי המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (NSF-GRFP) מענק DGE – 1644869 והמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), פרס מספר F99NS124180 NIH NINDS גיוון מיוחד F99 (ל- CKCO), מכון העיניים הלאומי (NEI) 5T32EY013933 (ל- AMP), המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (RO1 NS081333, R03 NS099920 ל-CMT), ומשרד ההגנה צבא/חיל האוויר (DURIP ל-CMT).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
Riferimenti
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
