Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Summary

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Abstract

Las membranas celulares son ambientes muy concurridos para las reacciones biomoleculares y la señalización. Sin embargo, la mayoría de los experimentos in vitro que investigan la interacción de proteínas con lípidos emplean membranas bicapa desnudas. Tales sistemas carecen de las complejidades del hacinamiento por proteínas y glicanos incrustados en la membrana y excluyen los efectos de volumen asociados encontrados en las superficies de la membrana celular. Además, la superficie de vidrio cargada negativamente sobre la que se forman las bicapas lipídicas impide la libre difusión de las biomoléculas transmembrana. Aquí, presentamos una membrana polimérico-lípida bien caracterizada como un imitador de membranas lipídicas abarrotadas. Este protocolo utiliza lípidos conjugados con polietilenglicol (PEG) como un enfoque generalizado para incorporar crowders en la bicapa lipídica soportada (SLB). En primer lugar, se presenta un procedimiento de limpieza de los portaobjetos microscópicos y cubreobjetos para realizar experimentos de una sola molécula. A continuación, se discuten los métodos para caracterizar los PEG-SLB y realizar experimentos de una sola molécula de unión, difusión y ensamblaje de biomoléculas utilizando el seguimiento de una sola molécula y el fotoblanqueo. Finalmente, este protocolo demuestra cómo monitorear el ensamblaje de nanoporos de la toxina formadora de poros bacteriana citolisina A (ClyA) en membranas lipídicas abarrotadas con análisis de fotoblanqueo de una sola molécula. También se incluyen códigos de MATLAB con datasets de ejemplo para realizar algunos de los análisis comunes, como el seguimiento de partículas, la extracción de comportamiento difusivo y el recuento de subunidades.

Introduction

Las membranas celulares son sistemas muy concurridos y complejos¹. El hacinamiento molecular puede tener un impacto considerable en la difusión de entidades unidas a la membrana como proteínas y lípidos ^2,3,4. Del mismo modo, las reacciones bimoleculares en las membranas lipídicas como la dimerización del receptor o la oligomerización de los complejos de membrana están influenciadas por el hacinamiento ^5,6,7. La naturaleza, configuración y concentración de los crowders pueden gobernar la unión a la membrana, la difusividad y la interacción proteína-proteína de varias maneras ^8,9. Dado que controlar el apiñamiento de la membrana en las membranas celulares e interpretar su influencia en las biomoléculas incrustadas es un desafío, los investigadores han tratado de establecer sistemas alternativos in vitro ¹⁰.

Un enfoque popular para las membranas artificiales apiñadas es dopar las membranas bicapa con lípidos injertados de polímero (como polietilenglicol, PEG)^11,12. Durante la visualización de la dinámica de proteínas y lípidos en bicapas lipídicas soportadas (SLB), estos polímeros también protegen los componentes incrustados en la membrana del sustrato subyacente cargado negativamente (como el vidrio) al levantar efectivamente la bicapa lejos del soporte subyacente. Al variar el tamaño y la concentración del polímero, se puede controlar el grado de apiñamiento molecular, así como su separación del soporte sólido subyacente^13,14. Esto es claramente una ventaja sobre las bicapas lipídicas soportadas sobre sustratos sólidos sin amortiguadores poliméricos^15,16, donde las biomoléculas transmembrana pueden perder su actividad^17,18,19. Más importante aún, nos permite recapitular el ambiente abarrotado de la membrana celular in vitro, que es crítico para muchos procesos de membrana.

Los polímeros injertados superficialmente en membranas también sufren cambios en su configuración dependiendo de su densidad de injerto¹². A bajas concentraciones, permanecen en una configuración entrópicomente enrollada, conocida como hongo, por encima de la superficie de la membrana. Con el aumento de la concentración, comienzan a interactuar y tienden a desenrollarse y extenderse, produciendo finalmente una densa formación en forma de cepillo en la membrana²¹. Dado que la transición del régimen de hongo al régimen de cepillo es altamente heterogénea y se manifiesta en condiciones poco caracterizadas del polímero, es importante utilizar condiciones bien caracterizadas para el apiñamiento en membranas injertadas de polímero. En comparación con un estudio reciente²⁰, identificamos e informamos composiciones de membrana abarrotadas que mantienen el transporte difusivo y la actividad de las biomoléculas transmembrana.

En este protocolo, discutimos cómo generar membranas lipídicas pegiladas y proporcionamos recomendaciones para densidades de PEG que imitan el hacinamiento en dos regímenes diferentes de configuración de polímeros (a saber, hongo y cepillo). El protocolo también describe la unión de moléculas individuales, el seguimiento de partículas y la adquisición y análisis de datos de fotoblanqueo para moléculas incrustadas en estas membranas abarrotadas. Primero, describimos los pasos de limpieza a fondo, el ensamblaje de la cámara de imágenes y la generación de PEG-SLB. En segundo lugar, proporcionamos detalles para los experimentos de unión de moléculas individuales, seguimiento de partículas y fotoblanqueo. En tercer lugar, discutimos i) extraer las afinidades de unión relativas, ii) caracterizar la difusión molecular, y iii) contar subunidades en un ensamblaje de proteínas a partir de películas de moléculas individuales en la membrana.

Si bien caracterizamos este sistema con imágenes de una sola molécula, el protocolo es útil para todos los biofísicos de membrana interesados en comprender el efecto del hacinamiento en las reacciones biomoleculares en las membranas lipídicas. En general, presentamos una sólida cartera para hacer bicapas lipídicas abarrotadas y soportadas, junto con varios ensayos de moléculas individuales realizados en ellas y las rutinas de análisis correspondientes.

Protocol

1. Limpieza del portaobjetos y del cubreobjetos para experimentos de una sola molécula Antes del montaje de la cámara de imágenes, limpie y prepare tanto los cubreobjetos como los portaobjetos. Perfore varios pares de agujeros en las guías de vidrio utilizando una máquina perforadora con brocas recubiertas de diamante (0.5-1 mm de diámetro). Si se utilizan láminas de acrílico, utilice un cortador láser para hacer agujeros precisos (0,5 mm), como se muestra en la Fi…

Representative Results

Monitorización de la unión de la proteína ClyA en membranas PEGiladasDespués del paso 4.5, la cinética de unión se estima trazando el número de partículas que se unen a la superficie de la membrana a lo largo del tiempo (Video 1). A medida que la proteína ClyA se une a una membrana con 5 lípidos mol% PEG2000, la densidad de partículas aumenta y alcanza la saturación (Figura 5). Un ajuste de decaimiento exponencial a las partículas unidas (c?…

Discussion

Aquí, demostramos experimentos de una sola molécula en bicapas lipídicas soportadas (SLB) que manifiestan un ambiente abarrotado para biomoléculas incrustadas en membrana. El ambiente hacinado genera un efecto de volumen excluido, lo que lleva a la mejora de las reacciones biomoleculares 1,2,39,40. Para el sistema PEG-lipídico, donde el polímero ocupa principalmente el volumen fuera de la…

Materials

2.5 ml Syringes	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin	Plastic syringe
Acetone	Finar Chemicals	10020LL025
Acrylic Sheet			2 mm thick
Acrylic Sheet	BigiMall		2 mm, Clear
Bath Sonicator	Branson	CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform	Sigma	528730	HPLC grade
Cholesterol	Avanti	700100
Coplin Jar	Duran Wheaton Kimble	S6016	8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips	VWR	631-1574	24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand	IDT		GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3)	Cytiva Life Sciences	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1	Sigma Aldrich		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T
DNA Connector Strand 2	Sigma Aldrich		CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand	Biomers		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape	3M	LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated)			0.5 – 1 mm
Drilling Machine	Dremel	220	Workstation
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads	Invitrogen	F10720
Glass Slides	Blue Star		Micro Slides, PIC-1
Glass Vials	Sigma	854190
Hydrogen Peroxide	Lobachemie	00182	30% Solution, AR Grade
Labolene	Thermo-Fischer Scientific		Detergent
Laser 532 nm	Coherent	Sapphire
Laser Cutter	Universal Laser Systems	ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE	Avanti	810150	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol	Finar Chemicals	30932LL025
Microscope	Olympus	IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS)			1X
Plasma Cleaner	Harrick Plasma Inc	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE1010	High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps	Sigma	27141
PTFE Tubing	Cole-Parmer	WW-06417-21	Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid	SD Fine Chemicals		98%, AR Grade
TIRF Objective	Olympus	UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator	Tarsons
Vortex Mixer	Tarsons