इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री का उपयोग करके डीएनए एपटामर और टेट्रासाइक्लिन के थर्मोडायनामिक और काइनेटिक एसोसिएशन का निर्धारण करना
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल डीएनए एपटामर और टेट्रासाइक्लिन के बीच बंधन के जुड़ाव और पृथक्करण कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) के उपयोग का वर्णन करता है, जिसमें नमूना तैयार करना, मानक चलाना और नमूने शामिल हैं, और परिणामी डेटा की व्याख्या करना शामिल है।
Abstract
एपटामर और उसके लक्ष्य के बीच बाध्यकारी आत्मीयता और व्यवहार का निर्धारण आवेदन के लिए एपटामर का चयन और उपयोग करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। एपटामर और छोटे अणुओं के बीच भारी अंतर के कारण, वैज्ञानिकों को उनके बाध्यकारी गुणों को चिह्नित करने में बहुत प्रयास करने की आवश्यकता है। आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) इस उद्देश्य के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। आईटीसी विघटन स्थिरांक (केडी) को निर्धारित करने से परे जाता है और समाधान चरण में दो अणुओं के बीच बातचीत के थैलेपी परिवर्तन और बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री प्रदान कर सकता है। यह दृष्टिकोण लेबल-मुक्त अणुओं का उपयोग करके निरंतर अनुमापन का संचालन करता है और प्रत्येक अनुमापन द्वारा उत्पादित बाध्यकारी घटनाओं पर समय के साथ जारी गर्मी को रिकॉर्ड करता है, इसलिए प्रक्रिया मैक्रोमोलेक्यूल्स और उनके छोटे लक्ष्यों के बीच बंधन को संवेदनशील रूप से माप सकती है। यहां, लेख एक छोटे लक्ष्य, टेट्रासाइक्लिन के साथ चयनित एपटामर के आईटीसी माप की चरण-दर-चरण प्रक्रिया का परिचय देता है। यह उदाहरण तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा और अन्य अनुप्रयोगों के लिए इसकी क्षमता को साबित करता है।
Introduction
एपटामर एसएसडीएनए या आरएनए टुकड़े हैं जिन्हें वांछित लक्ष्य 1,2 के लिए उच्च बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता के साथ एक विकास प्रक्रिया के माध्यम से चुना जाता है, जो उन्नत पहचान तत्वों या रासायनिक एंटीबॉडी 3,4,5 के रूप में काम कर सकते हैं। इस प्रकार, अपने लक्ष्यों के लिए एपटामर की बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता एक एपटामर के चयन और आवेदन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, और इन लक्षण वर्णन उद्देश्यों के लिए आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। एपटामर के संबंध को निर्धारित करने के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है, जिसमें आईटीसी, सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर), कलरमेट्रिक अनुमापन, माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस (एमएसटी), और बायो-लेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई) शामिल हैं। उनमें से, आईटीसी समाधान चरण में दो अणुओं के थर्मोडायनामिक और गतिज संघ को निर्धारित करने के लिए नवीनतम तकनीकों में से एक है। यह दृष्टिकोण लेबल-मुक्त अणुओं का उपयोग करके निरंतर अनुमापन का संचालन करता है और प्रत्येक अनुमापन 6,7 द्वारा उत्पादित बाध्यकारी घटनाओं पर समय के साथ जारी गर्मी को रिकॉर्ड करता है। अन्य तरीकों के विपरीत, आईटीसी बाध्यकारी आत्मीयता, कई बाध्यकारी साइटों और थर्मोडायनामिक और गतिज संघ (चित्रा 1 ए) की पेशकश कर सकता है। इन प्रारंभिक मापदंडों से, गिब्स मुक्त ऊर्जा परिवर्तन और एन्ट्रॉपी परिवर्तन निम्नलिखित संबंधों का उपयोग करके निर्धारित किए जाते हैं:
त्रिभुज = त्रिभुज-T==================================================================
इसका मतलब है कि आईटीसी बाध्यकारी तंत्र (चित्रा 1 बी) को स्पष्ट करने के लिए आणविक बातचीत का एक पूर्ण थर्मोडायनामिक प्रोफ़ाइल प्रदान करता है। एपटामर और लक्ष्य के बीच काफी अलग आकारों के कारण एपटामर के साथ छोटे अणुओं के लिए बाध्यकारी संबंध का निर्धारण करना मुश्किल है। इस बीच, आईटीसी अणुओं को लेबल और स्थिर किए बिना संवेदनशील माप प्रदान कर सकता है, जो माप के दौरान एपटामर और लक्ष्य की प्राकृतिक संरचना को बनाए रखने का साधन प्रदान करता है। उल्लिखित विशेषताओं के साथ, आईटीसी का उपयोग एपटामर और छोटे लक्ष्यों के बीच बंधन के लक्षण वर्णन के लिए मानक विधि के रूप में किया जा सकता है।
गु समूह द्वारा चयन के बाद, इस एपटामर को विभिन्न प्लेटफार्मों के साथ एकीकृत किया गया था, जिसमें इलेक्ट्रोकेमिकल एपटामर-आधारित बायोसेंसर, एक प्रतिस्पर्धी एंजाइम-लिंक्ड एपटामर परख और एक माइक्रोटिटर प्लेट शामिल है, जो टेट्रासाइक्लिन 8,9,10 के उच्च-थ्रूपुट डिटेक्शन को प्राप्त कर सकता है। हालांकि, इसकी बाध्यकारी विशेषताओं को उचित मंच8 चुनने के लिए पर्याप्त रूप से स्पष्ट नहीं किया गया है; यह आईटीसी का उपयोग करके टेट्रासाइक्लिन के लिए एपटामर के बंधन को चिह्नित करने के लायक है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत विधि को टीए इंस्ट्रूमेंट्स के निर्देश के अनुसार संशोधित किया गया था और हमारे केंद्र में कई चयनित एपटामर और लक्ष्यों के बाध्यकारी आत्मीयता और ऊष्मप्रवैगिकी को निर्धारित करने के लिए पर्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एप्टाजेन एलएलसी से अनुसंधान और विकास फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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