Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

Summary

Viene dimostrato un flusso di lavoro per la quantificazione assoluta delle interazioni farmaco-cellula trasportatrice utilizzando la citometria a flusso per consentire una migliore valutazione razionale di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. Questo flusso di lavoro è applicabile ai vettori di droga di qualsiasi tipo.

Abstract

Una componente importante della progettazione di sistemi di somministrazione di farmaci riguarda come amplificare o attenuare le interazioni con specifici tipi di cellule. Ad esempio, un chemioterapico potrebbe essere funzionalizzato con un anticorpo per migliorare il legame alle cellule tumorali ("targeting") o funzionalizzato con glicole polietilenico per aiutare a eludere il riconoscimento delle cellule immunitarie ("stealth"). Anche a livello cellulare, ottimizzare il legame e l'assorbimento di un vettore di farmaci è un problema di progettazione biologica complesso. Pertanto, è importante separare la forza con cui un nuovo vettore interagisce con una cella dall'efficacia funzionale del carico di un vettore una volta consegnato a quella cella.

Per continuare l'esempio chemioterapico, "quanto bene si lega a una cellula tumorale" è un problema separato da "quanto bene uccide una cellula tumorale". I saggi quantitativi in vitro per questi ultimi sono ben consolidati e di solito si basano sulla misurazione della vitalità. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche pubblicate sulle interazioni cellula-vettore è qualitativa o semiquantitativa. Generalmente, queste misurazioni si basano sull'etichettatura fluorescente del vettore e, di conseguenza, riportano interazioni con le cellule in unità relative o arbitrarie. Tuttavia, questo lavoro può essere standardizzato ed essere reso assolutamente quantitativo con un piccolo numero di esperimenti di caratterizzazione. Tale quantificazione assoluta è preziosa, in quanto facilita confronti razionali, inter- e intra-classe di vari sistemi di somministrazione di farmaci: nanoparticelle, microparticelle, virus, coniugati anticorpo-farmaco, cellule terapeutiche ingegnerizzate o vescicole extracellulari.

Inoltre, la quantificazione è un prerequisito per successive meta-analisi o approcci di modellazione in silico . In questo articolo vengono presentate le guide video e un albero decisionale su come ottenere la quantificazione in vitro per i sistemi di somministrazione di farmaci carrier, che tengono conto delle differenze nelle dimensioni del vettore e nella modalità di etichettatura. Inoltre, vengono discusse ulteriori considerazioni per la valutazione quantitativa dei sistemi avanzati di somministrazione di farmaci. Questo è destinato a servire come una risorsa preziosa per migliorare la valutazione razionale e la progettazione per la prossima generazione di medicina.

Introduction

La progettazione di costrutti di somministrazione di farmaci che mostrano un comportamento specifico e progettato a seconda del tipo di cellula che incontrano ha attirato un notevole interesse di ricerca. I potenziali costrutti di somministrazione di farmaci o "vettori" includono formulazioni lipidiche, inorganici nano-coltivati, assemblaggi polimerici, vescicole extracellulari, cellule batteriche funzionalizzate o virus modificati. Tutti questi possono mostrare specificità di organi, tessuti o cellule a causa di proprietà fisiche, proprietà superficiali o funzionalizzazioni chimiche ingegnerizzate come l'attacco anticorpale ^1,2

Protocol

1. Scegliere il flusso appropriato

1. Seguire l'albero decisionale descritto nella Figura 1 per determinare il flusso di lavoro migliore (flusso) (Figura 2) per la configurazione sperimentale utilizzata. Fare riferimento alla discussione per ulteriori commenti su questa scelta di flusso.
2. Se si segue il flusso del citometro, continuare con i passaggi 2.1.1-2.2.7. Se si segue il flusso di massa, continuare con i passaggi 3.1.1.1-3.1.5.7.

Results

Come discusso in precedenza, diversi tipi di vettori di farmaci richiedono l'uso di tecniche diverse per la quantificazione assoluta dell'associazione cellula-vettore. Ad esempio, le particelle del guscio centrale di poli(acido metacrilico) (PMA_SH) stabilizzate con disolfuro a 633 nm sono abbastanza grandi e dense per il rilevamento utilizzando un citometro a flusso sensibile. Come tali, queste particelle sono state etichettate in modo fluorescente, quindi controllate e contate utilizzando la diffusione della .......

Discussion

La caratterizzazione delle interazioni tra vettori di farmaci e cellule sta diventando sempre più importante nello sviluppo di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. In particolare, per consentire la valutazione razionale e il confronto di vari costrutti di portatori, è fondamentale quantificare in modo assoluto le prestazioni di detto vettore per interagire con cellule target e off-target. Questo protocollo descrive una metodologia a due flussi che consente a qualsiasi ricercatore che lavora con un vettore di far.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	colorante a pH stabile utilizzato per etichettare portatori PMASH a 633 nm da 150 nm, 235 nm o 633 nm; esempio di buon colorante da utilizzare negli studi di associazione cellula-portatore
Apogee A50 Microflow	Apogee		Citometro a flusso sensibile in grado di rilevare piccoli portatori per il conteggio
Citometro a flusso CytoFLEX S	Beckman Coulter		Citometro a flusso sensibile in grado di rilevare piccoli vettori per il conteggio e leggere per gli esperimenti finali di barriera cellulare
Software FCS Express	De Novo Software		utilizzato per analizzare i dati della citometria a flusso, ovvero eseguire il gating e derivare i valori mediani di intensità della fluorescenza delle popolazioni scelte. Le alternative includono FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Strumento standard per la lettura di micropiastre utilizzato per le misure di fluorescenza di massa di vettori in soluzione
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Citometro a flusso meno sensibile, ma più generalmente disponibile per i ricercatori. Può essere utilizzato per leggere l'esperimento finale del vettore cellulare
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument utilizzato per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle
Prism 8	GraphPad		Software utilizzato per rappresentare graficamente e calcolare curve standard. Le alternative includono Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python e molti altri,
kit MESF quantistici, Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	perle di quantificazione assoluta per citometria a flusso. Utilizzato per convertire le intensità di fluorescenza misurate in massa su un lettore di micropiastre in intensità di fluorescenza misurate su un citometro a flusso utilizzando lo standard MESF