यह प्रोटोकॉल बताता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन सामग्री का उपयोग करके मोतियों की सतहों पर एक्टिन धूमकेतु का उत्पादन कैसे किया जाए। ऐसी प्रणालियां कोशिकाओं में पाई जाने वाली प्रोट्रूसिव संरचनाओं की नकल करती हैं, और इसका उपयोग सरलीकृत तरीके से बल उत्पादन के शारीरिक तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
कई सेल आंदोलनों और आकार में परिवर्तन और कुछ प्रकार के इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल और ऑर्गेनेल गतिशीलता बायोपॉलीमर एक्टिन द्वारा संचालित होते हैं जो सेल, ऑर्गेनेल या जीवाणु की सतह पर एक गतिशील नेटवर्क बनाते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान बल उत्पादन के जैव रासायनिक और यांत्रिक आधार का अध्ययन अक्रिय सतहों जैसे मोती पर एक कोशिकीय तरीके से एक्टिन-आधारित आंदोलन को पुन: उत्पन्न करके किया जा सकता है जो घटकों के नियंत्रित सेट के साथ कार्यात्मक और इनक्यूबेट होते हैं। उपयुक्त परिस्थितियों में, एक लोचदार एक्टिन नेटवर्क मोती की सतह पर इकट्ठा होता है और नेटवर्क विकास से उत्पन्न तनाव के कारण खुल जाता है, जिससे एक “एक्टिन धूमकेतु” बनता है जो मोती को आगे बढ़ाता है। हालांकि, इस तरह के प्रयोगों के लिए विभिन्न एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन के एक मेजबान के शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है, जो अक्सर उन्हें गैर-विशेषज्ञों की पहुंच से परे रखते हैं। यह लेख व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करके एक्टिन धूमकेतु और मोतियों की गतिशीलता को पुन: प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण देता है। मोती की गति, प्रक्षेपपथ और अन्य मापदंडों पर प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए मोती कोटिंग, मोती का आकार और गतिशीलता मिश्रण को बदला जा सकता है। इस परख का उपयोग विभिन्न एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन की जैव रासायनिक गतिविधियों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, और मात्रात्मक भौतिक माप करने के लिए जो एक्टिन नेटवर्क के सक्रिय पदार्थ गुणों पर प्रकाश डालते हैं। यह समुदाय के लिए एक उपयोगी उपकरण होगा, जो एक्टिन-बाध्यकारी प्रोटीन शुद्धिकरण में विशेषज्ञ ज्ञान के बिना इन विट्रो एक्टिन-आधारित गतिशीलता के अध्ययन को सक्षम करेगा।
कोशिकाओं में एक्टिन पोलीमराइजेशन को सेल सिग्नलिंग1 के डाउनस्ट्रीम एक्टिन फिलामेंट न्यूक्लियेशन के तंग विनियमन द्वारा स्थानिक और अस्थायी रूप से नियंत्रित किया जाता है। न्यूक्लियेशन एक एक्टिन ट्रिमर के गठन के माध्यम से होता है, और फिर नवजात फिलामेंट के दोनों छोर अनायास बहुलक होते हैं, हालांकि एक छोर दूसरे (नुकीले छोर) की तुलना में अधिक गतिशील (कांटेदार अंत) होता है। जब न्यूक्लियेशन और कांटेदार अंत पोलीमराइजेशन को एक सतह की ओर निर्देशित किया जाता है, तो वे गति के लिए कोशिका झिल्ली को बाहर धकेलने और ऊर्जा स्रोतके रूप में एटीपी हाइड्रोलिसिस के साथ सेल के अंदर माइक्रोन-आकार की वस्तुओं को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त बल (पिको-टू-नैनो न्यूटन रेंज में) उत्पन्न करते हैं। कुछ उदाहरणों में लिस्टेरिया मोनोसाइटोजेन्स बैक्टीरिया शामिल हैं जो कोशिका से कोशिका में फैलने के लिए एक्टिन धूमकेतु का उपयोग करते हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया, जहां माइटोसिस 4,5 के दौरान यादृच्छिक विरासत के लिए एक्टिन धूमकेतु-आधारित आंदोलन महत्वपूर्ण है। एंडोसोम और अन्य इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं पर एक्टिन धूमकेतु को दाता झिल्ली 6,7,8 से अलगाव में फंसाया जाता है।
यहां प्रस्तुत विधि के साथ, सेलुलर एक्टिन पोलीमराइजेशन के सिग्नलिंग पहलुओं को दरकिनार कर दिया जाता है, और एक्टिन पोलीमराइजेशन को माइक्रोमेट्रिक पॉलीस्टाइनिन मोतियों पर ब्रांकेड एक्टिन न्यूक्लियेशन के सक्रियकर्ताओं के साथ कोटिंग करके उत्पादित किया जाता है, विशेष रूप से मानव डब्ल्यूएएसपी प्रोटीन के सक्रिय डोमेन, वीसीए (जिसे डब्ल्यूए या डब्ल्यूसीए भी कहा जाता है)1। लेपित मोतियों को तब एक मिश्रण में इनक्यूबेट किया जाता है जिसमें एक्टिन पोलीमराइजेशन के लिए आवश्यक तत्व होते हैं, जिसमें कोशिकाओं में मुख्य एक्टिन पोलीमराइजेशन न्यूक्लेटर, एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स शामिल है, जिसे वीसीए द्वारा बीड़ी की सतह पर सक्रिय किया जाता है ताकि बेटी फिलामेंट्स1 के किनारों से शाखाओं के रूप में नए फिलामेंट्स बनाए जा सकें। एक्टिन शुरू में मोती के चारों ओर समान रूप से बहुलक होता है, लेकिन फिर अनायास एक एक्टिन धूमकेतु बनाने के लिए समरूपता को तोड़ता है जो मोती को आगे बढ़ाता है, जिससे सेल जैसे प्रोट्रूसिव नेटवर्क और धूमकेतु को नियंत्रित तरीके से फिर से बनाया जाता है। मोतियों और अन्य लेपित सतहों के साथ इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग अतीत में हमारे और अन्य लोगों द्वारा एक्टिन पोलीमराइजेशन 9,10,11,12 के जैव रसायन और बायोफिज़िक्स का अध्ययन करने के लिए किया गया है, लेकिन इन प्रयोगों के लिए एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन में व्यापक विशेषज्ञता की आवश्यकता थी। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध (या जल्द ही उपलब्ध होने वाले) अभिकर्मकों के साथ पूरी तरह से एक्टिन धूमकेतु और गतिशीलता कैसे बनाई जाए, जिससे यह दृष्टिकोण किसी के लिए भी सुलभ हो जाता है, जिसमें बायोफिज़िकल अवधारणाओं को पढ़ाने के लिए शैक्षिक सेटिंग भी शामिल है। मुख्य विशेषताओं में कोमल और विश्वसनीय पिपेटिंग का महत्व, एक्टिन स्रोत के रूप में प्रोफाइलिन-जटिल मोनोमर का उपयोग, और एक मोती कोटिंग अभिकर्मक के रूप में अत्यधिक सक्रिय अप्रैल 2/3 कॉम्प्लेक्स एक्टिवेटर का उपयोग करने की अनिवार्यता शामिल है।
यहां विस्तृत प्रोटोकॉल बताता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन का उपयोग करके मोती सतहों, धूमकेतु गठन और मोती गतिशीलता पर एक्टिन नेटवर्क वृद्धि कैसे प्राप्त की जाए। हालांकि, कभी-कभी धूमकेतु ओं को पुन: नहीं देखा जाता है या स्लाइड और कवरस्लिप के बीच असंगत होते हैं। निम्नलिखित चर्चा प्रोटोकॉल में कुछ प्रमुख बिंदुओं पर जोर देती है और कुछ मापदंडों का सुझाव देती है जिन्हें समायोजित किया जा सकता है। ध्यान रखने योग्य एक कारक यह है कि धूमकेतु गठन और मोती की गति तापमान से प्रभावित होती है, जिसमें तापमान 25 डिग्री सेल्सियस से बहुत अधिक या 23 डिग्री सेल्सियस से बहुत नीचे होता है जो धूमकेतु के गठन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है और अपरिवर्तनीय डेटा देता है। जलवायु-नियंत्रित कमरे में तापमान-नियंत्रित माइक्रोस्कोप या माइक्रोस्कोप का उपयोग दृढ़ता से अनुशंसित है। यद्यपि फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एक्टिन को अक्सर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा धूमकेतु का निरीक्षण करने के लिए गतिशीलता मिश्रण में शामिल किया जाता है, एक बार धूमकेतु लंबाई में एक मोती व्यास से अधिक होते हैं, तो वे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा मोती के बगल में एक अंधेरे स्मीयर के रूप में भी दिखाई देते हैं। फेज कंट्रास्ट विज़ुअलाइज़ेशन टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए अधिक उपयुक्त है क्योंकि कुछ फोटोटॉक्सिसिटी स्पिनिंग डिस्क के माध्यम से भी फ्लोरेसेंस इमेजिंग से जुड़ी होती है। क्योंकि मोती समय के साथ बस जाते हैं, एक उल्टा माइक्रोस्कोप एक सीधे की तुलना में कम क्षैतिज मोती बहाव पैदा करता है और फिल्मों के लिए अधिक उपयुक्त है। स्लाइड को सील करने के लिए पिघला हुआ वलप का उपयोग महत्वपूर्ण है क्योंकि नेल पॉलिश जैसे पदार्थ धूमकेतु के गठन में हस्तक्षेप करते हैं। बड़ी मात्रा में VALAP को एक बीकर में बनाया जा सकता है, और फिर छोटे बीकर को तेजी से पिघलने के लिए अधिक अनुकूल बनाने के लिए निकाला जा सकता है। कमरे के तापमान पर VALAP वर्षों के लिए अच्छा है।
एक अन्य प्रमुख तकनीकी पहलू सावधानीपूर्वक बफर और गतिशीलता मिश्रण तैयारी है। एमबी 13 तैयार करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, विशेष रूप से पीएच समायोजन चरण पर। एटीपी हाइड्रोलिसिस से बचने के लिए एमबी 13 के पीएच को एनएओएच के साथ तटस्थ करने के लिए तेजी से समायोजित किया जाना चाहिए, लेकिन बहुत जल्दी नहीं क्योंकि ईजीटीए घुलनशील होता है क्योंकि पीएच तटस्थ तक पहुंचता है। ईजीटीए एक प्रमुख घटक है क्योंकि यह एक्टिन से बंधे कैल्शियम को जटिल करता है, गतिशीलता मिश्रण में अधिक सक्रिय मैग्नीशियम फॉर्म16 देता है। बहुत जल्दी या बहुत धीरे-धीरे तैयार किया गया एमबी 13 उप-धूमकेतु गठन देता है या यहां तक कि कोई भी नहीं। एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण बिंदु परिस्थितियों के साथ खेलते समय गतिशीलता मिश्रण में केसीएल एकाग्रता का सावधानीपूर्वक ट्रैक रखना है। उदाहरण के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण में 1x MB13 का उपयोग करते समय और प्रोफाइलिन को पतला करते समय, प्रोटीन को कैप करना, और MB13 में Arp2/3 कॉम्प्लेक्स, गतिशीलता प्रतिक्रिया में अंतिम KCl एकाग्रता लगभग 40-50 mM होती है। यह एकाग्रता धूमकेतु परख में सबसे अच्छा परिणाम देती है, और 60 एमएम केसीएल से अधिक एआरपी 2/3 जटिल न्यूक्लियेटिंग गतिविधि को कम करता है।
चीजों के प्रोटीन पक्ष पर, एक्टिन धूमकेतु प्राप्त करने का एक महत्वपूर्ण तकनीकी पहलू वाणिज्यिक एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन का उचित संचालन है, विशेष रूप से माइक्रोलीटर मात्रा का सटीक पाइपिंग। ब्रैडफोर्ड मानक वक्र की रैखिकता पिपेटिंग का एक अच्छा परीक्षण है और वक्र का उपयोग प्रोटीन सांद्रता के नियमित माप के लिए किया जा सकता है। दरअसल, धूमकेतु प्रक्रिया के लिए पुन: निलंबित वाणिज्यिक प्रोटीन का उपयोग करते समय, हमेशा प्रोटीन सांद्रता को सत्यापित करना महत्वपूर्ण होता है, क्योंकि पुनर्निलंबन के दौरान बैच परिवर्तनशीलता और उपयोगकर्ता त्रुटि वास्तविक और अपेक्षित सांद्रता के बीच अंतर पैदा कर सकती है। कभी-कभी प्रोटीन सांद्रता में छोटे अंतर धूमकेतु की पूर्ण अनुपस्थिति का कारण बन सकते हैं।
यहां प्रस्तुत विधि का एक और महत्वपूर्ण पहलू पोलीमराइजेशन के लिए ईंधन के रूप में प्रोफाइलिन-कॉम्प्लेक्स जी-एक्टिन का उपयोग है। ऐतिहासिक रूप से, इन विट्रो सिस्टम ने एक्टिन स्रोत के रूप में प्री-पोलीमराइज्ड फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन) का उपयोग किया: सतह पर थोक फेड पोलीमराइजेशन में डिपोलीमराइजेशन10,17। इसमें जी-एक्टिन के स्तर को नियंत्रित करने का लाभ था, लेकिन जटिलता की एक परत को जोड़ा गया, जिसमें डिपोलीमराइजेशन को उत्प्रेरित करने के लिए अतिरिक्त घटकों की आवश्यकता होती है। चूंकि बल उत्पादन और गतिशीलता के लिए एक्टिन नेटवर्क का कारोबार आवश्यक नहीं है, जो मोती की सतह पर न्यूक्लियेशन और पोलीमराइजेशन द्वारा संचालित होते हैं, जबकि एडीएफ / कोफिलिन जैसे एक्टिन डिपोलीमराइजेशन कारक सतह18 से दूर वृद्ध नेटवर्क पर कार्य करते हैं, एक्टिन-आधारित गतिशीलता का अधिकांश इन विट्रो पुनर्गठन अब सादगी के लिए कारोबार के बिना किया जाता है। हालांकि, जी-एक्टिन का उपयोग करने के लिए कुछ कमियां हैं। सबसे पहले, वाणिज्यिक एक्टिन का उपयोग करते समय, जिसे लियोफिलाइज्ड किया गया है, ऑलिगोमर्स मौजूद हैं। यहां वर्णित डीपोलीमराइजेशन चरण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने में बहुत महत्वपूर्ण हैं। विशेष रूप से, हालांकि जी-बफर को पारंपरिक रूप से पीएच 8 में समायोजित किया जाता है, कम पीएच (पीएच 7, उदाहरण के लिए) इस लेख में वर्णित परख में बेहतर काम करता प्रतीत होता है, संभवतः क्योंकि कम पीएच डीपोलीमराइजेशन19 को बढ़ाता है। जी-एक्टिन का उपयोग करने का एक और नुकसान यह है कि एक बार नमक की स्थिति में पोलीमराइजेशन के लिए अनुमेय होने के बाद, सहज न्यूक्लियेशन होता है और एफ-एक्टिन थोक के साथ-साथ मोती की सतह पर भी बनता है। प्रोफाइलिन के साथ जी-एक्टिन को जटिल बनाना थोक और नुकीले अंत पोलीमराइजेशन में सहज न्यूक्लियेशन को दबा देता है, जिससे सतह20 पर न्यूक्लियेशन और कांटेदार एंड पोलीमराइजेशन दोनों पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। प्रोफाइलिन-जी-एक्टिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि सेल में अधिकांश एक्टिन इस रूप21 में मौजूद है। यहां, प्रोफाइलिन: एक्टिन के 1: 1 अनुपात का उपयोग किया जाता है; हालांकि, उच्च अनुपात (उदाहरण के लिए 3: 1) थोक में पोलीमराइजेशन को अधिक अच्छी तरह से रोकते हैं, हालांकि उच्च अनुपातकुछ हद तक एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स और कांटेदार अंत बढ़ाव को भी रोकते हैं।
धूमकेतु निर्माण के लिए कैपिंग गतिविधि भी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सतह-सक्रिय एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स24,25 द्वारा न्यूक्लियेशन के चक्रों के माध्यम से सतह पर नए एक्टिन के सम्मिलन को सुनिश्चित करता है। कैपिंग के बिना, एक्टिन बादल धूमकेतु बनाने के लिए समरूपता को नहीं तोड़ते हैं क्योंकि सतह पर पोलीमराइजेशन क्लाउड26 को तोड़ने के लिए पर्याप्त तनाव का निर्माण नहीं करता है। अतीत में, हमने घर-शुद्ध पुनः संयोजक माउस कैपिंग प्रोटीन 13 का उपयोग किया है, लेकिन इस लेख के लिए किए गएपरीक्षणों से संकेत मिलता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक मानव कैपिंग प्रोटीन समान रूप से प्रभावी है, जैसा कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गेलसोलिन है, हालांकि 10 गुना अधिक गेलसोलिन का उपयोग किया जाना है, और कुछ अनुप्रयोगों के लिए, यह उचित नहीं हो सकता है क्योंकि इसमें एक्टिन विच्छेदन गतिविधि के साथ-साथ कैपिंग27 भी है।
अंत में इस विधि की मजबूती एक बहुत ही सक्रिय एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स एक्टिवेटर, स्ट्रेप्टाविडिन-पीवीसीए (एसपीवीसीए) 28 के उपयोग में रहती है। एसपीवीसीए में एआरपी 2/3 जटिल बाइंडिंग डोमेन के अलावा डब्ल्यूएएसपी (पी डोमेन) के प्रोफाइलिन-जी-एक्टिन बाइंडिंग डोमेन शामिल हैं क्योंकि यह प्रोफाइलिन-जी-एक्टिन स्थितियों29 में सबसे कुशल पाया जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि स्ट्रेप्टाविडिन टैग का उपयोग, जिसे मूल रूप से बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन लिंक के माध्यम से सतह कार्यात्मककरण की अनुमति देने के लिए पेश किया गया था, में एआरपी 2/3 जटिल सक्रियण को बढ़ाने का अतिरिक्त प्रभाव पड़ता है, संभवतः इस तथ्य के कारण कि स्ट्रेप्टाविडिन एक टेट्रामर है और इस प्रकार सक्रियकर्ता को क्लस्टर करता है, जिसे एआरपी 2/3 जटिल गतिविधि30 को बढ़ाने के लिए जाना जाता है। . व्यावसायिक रूप से उत्पादित एसपीवीसीए वर्तमान में विकास में है और जल्द ही खरीद के लिए उपलब्ध होगा। यह आगे ध्यान दिया जाना चाहिए कि, हालांकि 2 μM SpVCA का 40 μL नियमित रूप से 3 सेमी2 मोती की सतह को कोट करने के लिए उपयोग किया जाता है, अन्य कोटिंग सांद्रता (उच्च और निम्न) भी काम करती है, और इन स्थितियों के साथ खेलने से अलग-अलग धूमकेतु विकास गति और आकृति विज्ञान मिलता है। दरअसल, जब धूमकेतु नहीं बनते हैं या धूमकेतु का आकार स्लाइड पर समरूप नहीं होता है, तो विभिन्न कोटिंग स्थितियों का परीक्षण किया जाना चाहिए, साथ ही गतिशीलता मिश्रण में विभिन्न केसीएल और प्रोफाइलिन सांद्रता भी होनी चाहिए। गतिशीलता मिश्रण में एक्टिन, एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स और कैपिंग प्रोटीन की सांद्रता को धूमकेतु गठन को अनुकूलित करने के लिए भी बदला जा सकता है, लेकिन हमारे हाथों में, इन अनुपातों को बदलना अक्सर भ्रामक परिणाम देता है।
निष्कर्ष निकालने के लिए, यहां वर्णित विधियां मोती की सतहों और गतिशीलता पर एक्टिन असेंबली का उत्पादन करती हैं, लेकिन किसी भी सतह जिसे एसपीवीसीए के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है, का उपयोग किया जा सकता है। ऐसे मामलों में जहां यहां वर्णित सोखना काम नहीं करता है, स्ट्रेप्टाविडिन मोइटी का उपयोग बायोटिनाइलेशन के बाद एसपीवीसीए को ब्याज की सतह पर संलग्न करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार गठित एक्टिन संरचनाओं, धूमकेतु या अन्यथा, का उपयोग एक्टिन नेटवर्क के विभिन्न जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल पहलुओं के परीक्षण के लिए किया जा सकता है, और विशेष रूप से माइक्रोपिपेट्स, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और लेजर एब्लेशन 15,26,31,32 के साथ भौतिक जोड़तोड़ के लिए उपयुक्त हैं। अनुसंधान समुदाय के लिए इसके उपयोग के अलावा, यहां वर्णित दृष्टिकोण स्नातक बायोफिज़िक्स छात्रों के लिए सक्रिय पदार्थ अवधारणाओं जैसे समरूपता तोड़ने और आत्म-संगठन का अध्ययन करने के लिए एक शिक्षण उपकरण के रूप में उपयुक्त है।
The authors have nothing to disclose.
हम ईमानदारी से LPENS में हमारे नए घर के सदस्यों को उनके गर्मजोशी से स्वागत के लिए स्वीकार करते हैं, और विशेष रूप से, ABCDJ टीम को उनकी सभी मदद और समर्थन के लिए। जेपी फाउंडेशन एआरसी (ग्रांट पीजेए 20191209604) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है, और सीएस मानव सीमांत विज्ञान कार्यक्रम संगठन (ग्रांट आरजीपी 0026/2020) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | A12373 (recently discontinued) | This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol. |
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 | Hypermol | 8153 | |
Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
Arp2/3 complex | Cytoskeleton | RP01P | |
ATP | Sigma | A7699 | |
BioSpectrometer, basic | Eppendorf | 035739 | |
Bradford Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
BSA, high quality | Sigma | A3059 | |
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) | Thermo Scientific | 23209 | |
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) | Home-purified (Reference 13) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
Capping protein (a1b2, human recombinant) | Hypermol | 8322 | |
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 | Olympus | discontinued | Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used. |
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) | Eppendorf | 035963 | |
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL | Eppendorf | 035969 | |
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) | Cytoskeleton | HPG6 | |
Lanolin | Sigma | 49909 | |
Microcentrifuge 5427R + rotor | Eppendorf | 934126 | |
Microscope, upright: BX51 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
Microscope, inverted: IX70 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
Paraffin | Sigma | 76244 | |
Petroleum jelly: Vaseline | Sigma | 16415 | |
Pipettes Research Plus | Eppendorf | Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example). | |
**10 µL | 933954 | ||
**2.5 µL | 933953 | These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended. | |
Polystyrene carboxylate beads | Polysciences | ||
**approx. 1 µm diameter | 08226 | ||
**approx. 4.5 µm diameter | 17140-5 | ||
Profilin 1 (human recombinant, untagged) | Cytoskeleton | PR02 | |
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) | Home-purified (Reference 14) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) | Cytoskeleton | VCG03 |