Denne protokollen beskriver hvordan man produserer aktinkometer på overflaten av perler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige proteiningredienser. Slike systemer etterligner de fremspringende strukturer som finnes i celler, og kan brukes til å undersøke fysiologiske mekanismer for kraftproduksjon på en forenklet måte.
Mange cellebevegelser og formendringer og visse typer intracellulær bakteriell og organell motilitet drives av biopolymeraktin som danner et dynamisk nettverk på overflaten av cellen, organellen eller bakterien. Det biokjemiske og mekaniske grunnlaget for kraftproduksjon under denne prosessen kan studeres ved å reprodusere aktinbasert bevegelse på en acellulær måte på inerte overflater som perler som funksjonaliseres og inkuberes med et kontrollert sett med komponenter. Under passende forhold samles et elastisk aktinnettverk på perleoverflaten og bryter opp på grunn av spenningen som genereres av nettverksvekst, og danner en “aktinkomet” som driver perlen fremover. Imidlertid krever slike eksperimenter rensing av en rekke forskjellige aktinbindende proteiner, og setter dem ofte utenfor rekkevidden til ikke-spesialister. Denne artikkelen beskriver en protokoll for reproduserbar innhenting av aktinkometer og motilitet av perler ved bruk av kommersielt tilgjengelige reagenser. Perlebelegg, perlestørrelse og motilitetsblanding kan endres for å observere effekten på perlehastighet, baner og andre parametere. Denne analysen kan brukes til å teste de biokjemiske aktivitetene til forskjellige aktinbindende proteiner, og for å utføre kvantitative fysiske målinger som kaster lys over aktive materieegenskaper til aktinnettverk. Dette vil være et nyttig verktøy for samfunnet, som muliggjør studier av in vitro aktinbasert motilitet uten ekspertkunnskap i aktinbindende proteinrensing.
Aktinpolymerisasjon i celler styres romlig og tidsmessig ved tett regulering av aktinfilamentkjernering nedstrøms for cellesignalering1. Nukleering skjer via dannelsen av en aktintrimer, og deretter polymeriseres begge ender av det begynnende filamentet spontant, selv om den ene enden er mer dynamisk (piggenden) enn den andre (den spisse enden)2. Når nukleering og piggendepolymerisasjon er rettet mot en overflate, produserer de nok kraft (i pico-til-nano Newton-serien) til å skyve ut cellemembranen for bevegelse og å flytte mikronstørrelsesobjekter inne i cellen med ATP-hydrolyse som energikilde3. Noen eksempler inkluderer Listeria monocytogenes bakterier som bruker aktinkometer til å spre seg fra celle til celle, og mitokondrier, hvor aktin kometbasert bevegelse er viktig for randomisert arv under mitose 4,5. Aktinkometer på endosomer og andre intracellulære vesikler er involvert i løsrivelse fra donormembraner 6,7,8.
Med metoden som presenteres her, blir signalaspektene ved cellulær aktinpolymerisering omgått, og aktinpolymerisasjon produseres på mikrometriske polystyrenperler ved å belegge dem med aktivatorer av forgrenet aktinkjernering, spesielt det aktive domenet til det humane WASP-proteinet, VCA (også kalt WA eller WCA)1. De belagte perlene inkuberes deretter i en blanding som inneholder ingrediensene som er nødvendige for aktinpolymerisering, inkludert hovedaktinpolymerisasjonskjernen i celler, Arp2/3-komplekset, som aktiveres av VCA på perleoverflaten for å danne nye filamenter som grener av sidene av datterfilamenter1. Aktin polymeriserer først jevnt rundt perlen, men bryter deretter spontant symmetrien for å skape en aktinkomet som skyver perlen fremover, og derved gjenskaper cellelignende fremspringende nettverk og kometer på en kontrollert måte. Lignende tilnærminger med perler og andre belagte overflater har tidligere blitt brukt av oss og andre for å studere biokjemi og biofysikk av aktinpolymerisasjon 9,10,11,12, men omfattende kompetanse innen aktinbindende proteiner var nødvendig for disse forsøkene. Protokollen som presenteres her beskriver hvordan man robust kan lage aktinkometer og motilitet helt med kommersielt tilgjengelige (eller snart tilgjengelige) reagenser, noe som gjør denne tilnærmingen tilgjengelig for alle, inkludert i en pedagogisk setting for undervisning i biofysiske konsepter. Nøkkelfunksjoner inkluderer viktigheten av skånsom og pålitelig pipettering, bruk av profilinkompleksmonomer som aktinkilde, og nødvendigheten av å bruke en svært aktiv Apr2/3 kompleks aktivator som et perlebeleggreagens.
Protokollen som er beskrevet her, beskriver hvordan man oppnår aktinnettverksvekst på perleoverflater, kometdannelse og perlemotilitet ved bruk av kommersielt tilgjengelige proteiner. Noen ganger observeres imidlertid ikke kometer reproduserbart eller er inhomogene mellom lysbildet og dekselet. Den følgende diskusjonen legger vekt på noen viktige punkter i protokollen og foreslår noen parametere som kan justeres. En faktor å huske på er at kometdannelse og dråpehastighet påvirkes av temperatur, med temperaturer mye over 25 ° C eller mye under 23 ° C som negativt påvirker kometdannelsen og gir ikke-reproduserbare data. Bruk av temperaturregulert mikroskop eller mikroskop i klimakontrollert rom anbefales på det sterkeste. Selv om fluorescerende merket aktin ofte er inkludert i motilitetsblandingen for å observere kometer ved fluorescensmikroskopi, når kometer er mer enn en perlediameter i lengde, er de også synlige ved fasekontrastmikroskopi som et mørkt smør ved siden av perlen. Fasekontrastvisualisering er mer hensiktsmessig for time-lapse-avbildning, da noe fototoksisitet er forbundet med fluorescensavbildning selv via spinnskive. Fordi perler legger seg over tid, produserer et omvendt mikroskop mindre horisontal perledrift enn en oppreist og er mer passende for filmer. Bruken av smeltet VALAP for å forsegle lysbilder er viktig da stoffer som neglelakk forstyrrer kometdannelsen. Store mengder VALAP kan lages i et beger, og deretter øses ut for å fylle opp mindre beger som er mer egnet til rask smelting. VALAP er bra i årevis ved romtemperatur.
Et annet viktig teknisk aspekt er omhyggelig klargjøring av buffer- og motilitetsblanding. Det må utvises forsiktighet ved tilberedning av MB13, spesielt ved justeringstrinnet for pH. PH på MB13 bør justeres raskt til nøytral med NaOH for å unngå ATP-hydrolyse, men ikke for raskt når EGTA oppløses når pH nærmer seg nøytral. EGTA er en viktig ingrediens fordi den komplekser kalsium bundet til aktin, noe som gir i motilitetsblandingen den mer aktive magnesiumformen16. MB13 fremstilt for raskt eller for sakte gir suboptimal kometdannelse eller til og med ingen i det hele tatt. Et annet viktig poeng er å holde nøye oversikt over KCl-konsentrasjonen i motilitetsblandingen når du spiller med forholdene. For eksempel, når du bruker 1x MB13 i reaksjonsblandingen og fortynner profilin, kappeprotein og Arp2/3-komplekset i MB13, er den endelige KCl-konsentrasjonen i motilitetsreaksjonen ca. 40-50 mM på grunn av fortynning med G-buffer. Denne konsentrasjonen gir de beste resultatene i kometanalysen, og mer enn 60 mM KCl reduserer Arp2/3 kompleks nukleeringsaktivitet.
På proteinsiden av ting er et kritisk teknisk aspekt ved å skaffe aktinkometer riktig håndtering av kommersielle aktinbindende proteiner, spesielt presis pipettering av mikrolitermengder. Lineariteten til Bradford-standardkurven er en god test av pipettering, og kurven kan deretter brukes til rutinemessige målinger av proteinkonsentrasjoner. Når man bruker resuspenderte kommersielle proteiner til kometprosedyren, er det derfor viktig å alltid verifisere proteinkonsentrasjoner, da batchvariabilitet og brukerfeil under resuspendering kan føre til forskjeller mellom reelle og forventede konsentrasjoner. Noen ganger kan små forskjeller i proteinkonsentrasjoner føre til fullstendig fravær av kometer.
Et annet viktig aspekt ved metoden som presenteres her er bruken av profilinkompleksert G-aktin som drivstoff for polymerisering. Historisk sett brukte in vitro-systemer prepolymerisert filamentøst aktin (F-aktin) som aktinkilde: depolymerisering i bulkfôret polymerisering på overflaten10,17. Dette hadde fordelen av å kontrollere G-aktinnivåer, men la til et lag av kompleksitet som krever ytterligere komponenter for å katalysere depolymerisering. Siden omsetning av aktinnettverket ikke er nødvendig for kraftproduksjon og motilitet, som drives av nukleering og polymerisering på overflaten av perlen, mens aktin-depolymeriseringsfaktorer som ADF / cofilin virker på de eldre nettverkene langt fra overflaten18, gjøres de fleste in vitro-rekonstituering av aktinbasert motilitet nå uten omsetning for enkelhets skyld. Det er imidlertid noen ulemper ved bruk av G-aktin. For det første, når du bruker kommersielt aktin, som har blitt lyofilisert, er oligomerer tilstede. Depolymerisasjonstrinnene beskrevet her er svært viktige for å oppnå reproduserbare resultater. Spesielt, selv om G-buffer tradisjonelt er justert til pH 8, ser lavere pH (pH 7, for eksempel) ut til å fungere bedre i analysene beskrevet i denne artikkelen, muligens fordi lav pH forbedrer depolymerisering19. En annen ulempe ved bruk av G-aktin er at når det er plassert i saltforhold som er tillatt for polymerisering, oppstår spontan nukleering og F-aktin dannes i bulk så vel som på perleoverflaten. Kompleksering av G-aktin med profilin undertrykker spontan nukleering i bulk og spiss endepolymerisasjon, og fokuserer dermed både nukleering og piggetapppolymerisasjon på overflaten20. Profilin-G-aktin er fysiologisk relevant, da mye av aktinet i cellen er tilstede i dette skjemaet21. Her brukes et 1: 1-forhold mellom profilin: actin; Imidlertid hemmer høyere forhold (for eksempel 3: 1) mer grundig polymerisasjon i bulk, selv om høyere forhold også hemmer Arp2/3-komplekset og piggenden forlengelse til en viss grad22,23.
Cappingaktivitet er også nøkkelen for kometdannelse siden det sikrer innsetting av nytt aktin på overflaten via sykluser av nukleering av overflateaktivert Arp2/3-kompleks24,25. Uten capping bryter ikke aktinskyer symmetrien for å danne kometer fordi polymerisasjon på overflaten ikke bygger opp nok spenning til å bryte opp skyen26. Tidligere har vi brukt hjemmerenset rekombinant musekappeprotein 13, men tester utført for denne artikkelen indikerer at kommersielt tilgjengelig rekombinant humant kappeprotein er like effektivt, som kommersielt tilgjengelig gelsolin, selv om10 ganger mer gelsolin må brukes, og for visse applikasjoner kan det ikke være hensiktsmessig da det har aktinavskjærende aktivitet samt capping27.
Endelig ligger robustheten til denne metoden i bruken av en veldig aktiv Arp2/3 kompleks aktivator, streptavidin-pVCA (SpVCA)28. SpVCA inkluderer profilin-G-actin-bindingsdomenet til WASP (p-domenet) i tillegg til Arp2/3-kompleksbindingsdomenet, da dette er funnet å være mest effektivt i profilin-G-actin-forhold29. Enda viktigere, bruken av streptavidin-taggen, opprinnelig introdusert for å tillate overflatefunksjonalisering via biotin-streptavidin-lenken, har den ekstra effekten av å øke Arp2/3-kompleksaktiveringen, antagelig på grunn av at streptavidin er en tetramer og dermed klynger aktivatoren, kjent for å øke Arp2/3 kompleks aktivitet30 . Kommersielt produserte SpVCA er for tiden under utvikling og vil snart være tilgjengelig for kjøp. Det skal videre bemerkes at selv om 40 μL av 2 μM SpVCA rutinemessig brukes til å belegge 3 cm2 perleoverflate, fungerer andre beleggkonsentrasjoner (høyere og lavere) også, og å leke med disse forholdene gir forskjellige kometveksthastigheter og morfologier. Faktisk, når kometer ikke dannes eller kometstørrelsen ikke er homogen på lysbildet, bør forskjellige beleggforhold testes, samt forskjellige KCl- og profilinkonsentrasjoner i motilitetsblandingen. Konsentrasjonene av aktin, Arp2/3-kompleks og kappeprotein i motilitetsblandingen kan også endres for å optimalisere kometdannelsen, men i våre hender gir endring av disse proporsjonene ofte forvirrende resultater.
For å konkludere, produserer metodene beskrevet her aktinmontering på perleoverflater og motilitet, men enhver overflate som kan funksjonaliseres med SpVCA kan brukes. I tilfeller der adsorpsjon som beskrevet her ikke virker, kan streptavidin-delen brukes til å feste SpVCA til overflaten av interesse etter biotinylering. Aktinstrukturene som dannes på denne måten, kometer eller på annen måte, kan brukes til å teste forskjellige biokjemiske og biofysiske aspekter ved aktinnettverk, og er spesielt egnet for fysiske manipulasjoner med mikropipetter, optisk pinsett og laserablasjoner 15,26,31,32. I tillegg til bruken til forskningsmiljøet, er tilnærmingen beskrevet her hensiktsmessig som et undervisningsverktøy for studenter i biofysikk for å studere aktive materiebegreper som symmetribrudd og selvorganisasjon.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner medlemmene av vårt nye hjem på LPENS for deres varme velkomst, og spesielt ABCDJ-teamet for all deres hjelp og støtte. JP anerkjenner økonomisk støtte fra stiftelsen ARC (Grant PJA 20191209604), og CS anerkjenner økonomisk støtte fra Human Frontiers Science Program Organization (Grant RGP0026/2020).
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | A12373 (recently discontinued) | This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol. |
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 | Hypermol | 8153 | |
Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
Arp2/3 complex | Cytoskeleton | RP01P | |
ATP | Sigma | A7699 | |
BioSpectrometer, basic | Eppendorf | 035739 | |
Bradford Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
BSA, high quality | Sigma | A3059 | |
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) | Thermo Scientific | 23209 | |
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) | Home-purified (Reference 13) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
Capping protein (a1b2, human recombinant) | Hypermol | 8322 | |
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 | Olympus | discontinued | Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used. |
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) | Eppendorf | 035963 | |
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL | Eppendorf | 035969 | |
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) | Cytoskeleton | HPG6 | |
Lanolin | Sigma | 49909 | |
Microcentrifuge 5427R + rotor | Eppendorf | 934126 | |
Microscope, upright: BX51 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
Microscope, inverted: IX70 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
Paraffin | Sigma | 76244 | |
Petroleum jelly: Vaseline | Sigma | 16415 | |
Pipettes Research Plus | Eppendorf | Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example). | |
**10 µL | 933954 | ||
**2.5 µL | 933953 | These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended. | |
Polystyrene carboxylate beads | Polysciences | ||
**approx. 1 µm diameter | 08226 | ||
**approx. 4.5 µm diameter | 17140-5 | ||
Profilin 1 (human recombinant, untagged) | Cytoskeleton | PR02 | |
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) | Home-purified (Reference 14) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) | Cytoskeleton | VCG03 |