Denne protokol beskriver, hvordan man producerer actinkometer på overfladen af perler ved hjælp af kommercielt tilgængelige proteiningredienser. Sådanne systemer efterligner de fremspringende strukturer, der findes i celler, og kan bruges til at undersøge fysiologiske mekanismer for kraftproduktion på en forenklet måde.
Mange cellebevægelser og formændringer og visse typer intracellulær bakteriel og organelmotilitet drives af biopolymer actin, der danner et dynamisk netværk på overfladen af cellen, organellen eller bakterien. Det biokemiske og mekaniske grundlag for kraftproduktion under denne proces kan studeres ved at reproducere actinbaseret bevægelse på en acellulær måde på inerte overflader såsom perler, der funktionaliseres og inkuberes med et kontrolleret sæt komponenter. Under de rette forhold samles et elastisk actinnetværk ved perleoverfladen og bryder op på grund af den stress, der genereres af netværksvækst, og danner en “actinkomet”, der driver perlen fremad. Sådanne eksperimenter kræver imidlertid oprensning af et væld af forskellige actinbindende proteiner, hvilket ofte sætter dem uden for ikke-specialisters rækkevidde. Denne artikel beskriver en protokol til reproducerbar opnåelse af actinkometer og motilitet af perler ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser. Perlebelægning, perlestørrelse og bevægelighedsblanding kan ændres for at observere effekten på perlehastighed, baner og andre parametre. Dette assay kan bruges til at teste de biokemiske aktiviteter af forskellige actinbindende proteiner og til at udføre kvantitative fysiske målinger, der kaster lys over aktive stofegenskaber af actinnetværk. Dette vil være et nyttigt værktøj for samfundet, der muliggør undersøgelse af in vitro actinbaseret motilitet uden ekspertviden inden for actinbindende proteinrensning.
Actinpolymerisation i celler styres rumligt og tidsmæssigt ved stram regulering af actinfilamentkernering nedstrøms for cellesignalering1. Nukleation sker via dannelsen af en actin trimer, og derefter polymeriserer begge ender af den spirende filament spontant, selvom den ene ende er mere dynamisk (den piggede ende) end den anden (den spidse ende)2. Når kimdannelse og pigtrådspolymerisation er rettet mod en overflade, producerer de tilstrækkelig kraft (i pico-til-nano Newton-området) til at skubbe cellemembranen ud til bevægelse og til at flytte objekter i mikronstørrelse inde i cellen med ATP-hydrolyse som energikilde3. Nogle eksempler inkluderer Listeria monocytogenes bakterier, der bruger actinkometer til at sprede sig fra celle til celle, og mitokondrier, hvor actinkometbaseret bevægelse er vigtig for randomiseret arv under mitose 4,5. Actinkometer på endosomer og andre intracellulære vesikler er impliceret i løsrivelse fra donormembraner 6,7,8.
Med den metode, der præsenteres her, omgås signalaspekterne af cellulær actinpolymerisation, og actinpolymerisation fremstilles på mikrometriske polystyrenperler ved at belægge dem med aktivatorer af forgrenet actinkernedannelse, specifikt det aktive domæne af det humane WASP-protein, VCA (også kaldet WA eller WCA)1. De belagte perler inkuberes derefter i en blanding indeholdende de ingredienser, der er nødvendige for actinpolymerisation, herunder hovedactinpolymerisationsnukleatoren i celler, Arp2/3-komplekset, som aktiveres af VCA ved perleoverfladen for at danne nye filamenter som grene fra siderne af datterfilamenter1. Actin polymeriserer oprindeligt ensartet omkring perlen, men bryder derefter spontant symmetrien for at skabe en actinkomet, der skubber perlen fremad og derved genskaber cellelignende fremspringende netværk og kometer på en kontrolleret måde. Lignende tilgange med perler og andre belagte overflader er tidligere blevet brugt af os og andre til at studere biokemi og biofysik af actinpolymerisation 9,10,11,12, men omfattende ekspertise inden for actinbindende proteiner var påkrævet for disse eksperimenter. Protokollen, der præsenteres her, beskriver, hvordan man robust skaber actinkometer og bevægelighed udelukkende med kommercielt tilgængelige (eller snart tilgængelige) reagenser, hvilket gør denne tilgang tilgængelig for alle, herunder i en uddannelsesmæssig ramme til undervisning i biofysiske begreber. Nøglefunktioner inkluderer vigtigheden af skånsom og pålidelig pipettering, brugen af profilinkomplekset monomer som actinkilde og væsentligheden ved at bruge en meget aktiv Apr2/3 kompleks aktivator som et perlebelægningsreagens.
Protokollen, der er beskrevet her, beskriver, hvordan man opnår actinnetværksvækst på perleoverflader, kometdannelse og perlemotilitet ved hjælp af kommercielt tilgængelige proteiner. Imidlertid observeres kometer undertiden ikke reproducerbart eller er inhomogene mellem diaset og dækslip. Den følgende diskussion understreger nogle nøglepunkter i protokollen og foreslår nogle parametre, der kan justeres. En faktor, man skal huske på, er, at kometdannelse og perlehastighed påvirkes af temperaturen, hvor temperaturer meget over 25 °C eller meget under 23 °C påvirker kometdannelsen negativt og giver uoprettelige data. Brug af et temperaturstyret mikroskop eller et mikroskop i et klimakontrolleret rum anbefales kraftigt. Selvom fluorescerende mærket actin ofte er inkluderet i motilitetsblandingen for at observere kometer ved fluorescensmikroskopi, når kometer er mere end en perlediameter i længden, er de også synlige ved fasekontrastmikroskopi som en mørk udstrygning ved siden af perlen. Fasekontrastvisualisering er mere passende til time-lapse-billeddannelse, da en vis fototoksicitet er forbundet med fluorescensbilleddannelse, selv via roterende disk. Fordi perler sætter sig over tid, producerer et omvendt mikroskop mindre vandret perledrift end en opretstående og er mere passende til film. Brugen af smeltet VALAP til at forsegle dias er vigtig, da stoffer som neglelak forstyrrer kometdannelsen. Store mængder VALAP kan fremstilles i et bægerglas og derefter skovles ud for at genopfylde mindre bægerglas, der er mere modtagelige for hurtig smeltning. VALAP er god i årevis ved stuetemperatur.
Et andet vigtigt teknisk aspekt er omhyggelig forberedelse af buffer og motilitetsblanding. Der skal udvises forsigtighed ved tilberedning af MB13, især ved pH-justeringstrinnet. PH-værdien i MB13 bør justeres hurtigt til neutral med NaOH for at undgå ATP-hydrolyse, men ikke for hurtigt, da EGTA opløses, når pH-værdien nærmer sig neutral. EGTA er en vigtig ingrediens, fordi det komplekser calcium bundet til actin, hvilket giver i motilitetsblandingen den mere aktive magnesiumform16. MB13 forberedt for hurtigt eller for langsomt giver suboptimal kometdannelse eller endda slet ingen. Et yderligere nøglepunkt er at holde nøje styr på KCl-koncentrationen i motilitetsblandingen, når man leger med forholdene. For eksempel, når der anvendes 1x MB13 i reaktionsblandingen og fortynding af profilin, capping protein og Arp2/3-komplekset i MB13, er den endelige KCl-koncentration i motilitetsreaktionen ca. 40-50 mM på grund af fortynding med G-buffer. Denne koncentration giver de bedste resultater i kometanalysen, og mere end 60 mM KCl nedsætter Arp2/3 kompleks nukleeringsaktivitet.
På proteinsiden af tingene er et kritisk teknisk aspekt ved opnåelse af actinkometer korrekt håndtering af kommercielle actinbindende proteiner, især præcis pipettering af mikrolitermængder. Lineariteten af Bradford-standardkurven er en god test af pipettering, og kurven kan derefter bruges til rutinemæssige målinger af proteinkoncentrationer. Når der anvendes resuspenderede kommercielle proteiner til kometproceduren, er det faktisk vigtigt altid at verificere proteinkoncentrationer, da batchvariation og brugerfejl under resuspension kan føre til forskelle mellem reelle og forventede koncentrationer. Nogle gange kan små forskelle i proteinkoncentrationer føre til fuldstændig fravær af kometer.
Et andet vigtigt aspekt af metoden, der præsenteres her, er brugen af profilinkomplekset G-actin som brændstof til polymerisation. Historisk set anvendte in vitro-systemer præpolymeriseret filamentøs actin (F-actin) som actinkilde: depolymerisering i bulkfodret polymerisation på overfladen10,17. Dette havde fordelen ved at kontrollere G-actin-niveauer, men tilføjede et lag af kompleksitet, der krævede yderligere komponenter for at katalysere depolymerisering. Da omsætning af actin-netværket ikke er nødvendig for kraftproduktion og motilitet, som drives af kimdannelse og polymerisation på overfladen af perlen, mens actin-depolymeriseringsfaktorer som ADF / cofilin virker på de gamle netværk langt fra overfladen18, udføres det meste in vitro-rekonstitution af actinbaseret motilitet nu uden omsætning for enkelhed. Der er dog nogle ulemper ved at bruge G-actin. For det første er oligomerer til stede, når man bruger kommerciel actin, som er blevet lyofiliseret. Depolymeriseringstrinnene beskrevet her er meget vigtige for at opnå reproducerbare resultater. Selvom G-buffer traditionelt er justeret til pH 8, synes lavere pH (f.eks. pH 7) at fungere bedre i de assays, der er beskrevet i denne artikel, muligvis fordi lav pH forbedrer depolymerisering19. En anden ulempe ved at bruge G-actin er, at når den først er placeret under saltforhold, der er tilladelige for polymerisation, forekommer spontan kimdannelse, og F-actin dannes i bulk såvel som på perleoverfladen. Kompleksdannelse af G-actin med profilin undertrykker spontan kimdannelse i bulk og spids endepolymerisation og derved fokuserer både kimdannelse og pigtrådspolymerisation på overfladen20. Profilin-G-actin er fysiologisk relevant, da meget af actinet i cellen er til stede i denne form21. Her bruges et 1:1-forhold mellem profilin:actin; imidlertid hæmmer højere forhold (for eksempel 3: 1) mere grundigt polymerisation i bulk, selvom højere forhold også hæmmer Arp2/3-komplekset og pigtrådsforlængelsen til en vis grad22,23.
Capping-aktivitet er også nøglen til kometdannelse, da det sikrer indsættelse af nyt actin på overfladen via kimdannelsescyklusser ved overfladeaktiveret Arp2/3-kompleks24,25. Uden at dække bryder actinskyer ikke symmetri for at danne kometer, fordi polymerisation ved overfladen ikke opbygger nok spænding til at bryde skyen op26. Tidligere har vi brugt hjemmerenset rekombinant musehætteprotein13, men test udført til denne artikel indikerer, at kommercielt tilgængeligt rekombinant humant cappingprotein er lige så effektivt, som det er kommercielt tilgængeligt gelsolin, selvom der skal anvendes 10x mere gelsolin, og til visse anvendelser er det muligvis ikke hensigtsmæssigt, da det har actin-afskæringsaktivitet samt capping27.
Endelig ligger robustheden af denne metode i brugen af en meget aktiv Arp2/3 kompleks aktivator, streptavidin-pVCA (SpVCA)28. SpVCA inkluderer profilin-G-actin-bindingsdomænet for WASP (p-domænet) ud over Arp2/3-kompleksbindingsdomænet, da dette viser sig at være mest effektivt under profilin-G-actin-forhold29. Endnu vigtigere er det, at brugen af streptavidin-mærket, der oprindeligt blev introduceret for at tillade overfladefunktionalisering via biotin-streptavidin-linket, har den yderligere virkning at øge Arp2/3-kompleksaktiveringen, formodentlig på grund af det faktum, at streptavidin er en tetramer og dermed klynger aktivatoren, kendt for at øge Arp2/3 kompleks aktivitet30 . Kommercielt produceret SpVCA er i øjeblikket under udvikling og vil snart kunne købes. Det skal endvidere bemærkes, at selvom 40 μL 2 μM SpVCA rutinemæssigt bruges til at belægge 3 cm2 perleoverflade, fungerer andre belægningskoncentrationer (højere og lavere) også, og at lege med disse forhold giver forskellige kometvæksthastigheder og morfologier. Når der ikke dannes kometer, eller kometstørrelsen ikke er homogen på rutsjebanen, bør der testes forskellige belægningsforhold samt forskellige KCl- og profilinkoncentrationer i motilitetsblandingen. Koncentrationerne af actin, Arp2/3-kompleks og capping-protein i motilitetsblandingen kan også ændres for at optimere kometdannelsen, men i vores hænder giver ændring af disse proportioner ofte forvirrende resultater.
Afslutningsvis producerer de her beskrevne metoder actinsamling på perleoverflader og bevægelighed, men enhver overflade, der kan funktionaliseres med SpVCA, kan bruges. I tilfælde, hvor adsorption som beskrevet her ikke virker, kan streptavidin-delen bruges til at fastgøre SpVCA til overfladen af interesse efter biotinylering. De således dannede actinstrukturer, kometer eller på anden måde, kan bruges til at teste forskellige biokemiske og biofysiske aspekter af actinnetværk og er især velegnede til fysiske manipulationer med mikropipetter, optisk pincet og laserablationer 15,26,31,32. Ud over dets anvendelser for forskersamfundet er den tilgang, der er beskrevet her, passende som et undervisningsværktøj for bachelorstuderende i biofysik til at studere aktive stofbegreber som symmetribrud og selvorganisering.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender oprigtigt medlemmerne af vores nye hjem på LPENS for deres varme velkomst, og især ABCDJ-teamet for al deres hjælp og støtte. J.P. anerkender økonomisk støtte fra Foundation ARC (Grant PJA 20191209604), og CS anerkender økonomisk støtte fra Human Frontiers Science Program Organization (Grant RGP0026/2020).
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | A12373 (recently discontinued) | This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol. |
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 | Hypermol | 8153 | |
Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
Arp2/3 complex | Cytoskeleton | RP01P | |
ATP | Sigma | A7699 | |
BioSpectrometer, basic | Eppendorf | 035739 | |
Bradford Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
BSA, high quality | Sigma | A3059 | |
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) | Thermo Scientific | 23209 | |
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) | Home-purified (Reference 13) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
Capping protein (a1b2, human recombinant) | Hypermol | 8322 | |
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 | Olympus | discontinued | Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used. |
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) | Eppendorf | 035963 | |
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL | Eppendorf | 035969 | |
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) | Cytoskeleton | HPG6 | |
Lanolin | Sigma | 49909 | |
Microcentrifuge 5427R + rotor | Eppendorf | 934126 | |
Microscope, upright: BX51 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
Microscope, inverted: IX70 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
Paraffin | Sigma | 76244 | |
Petroleum jelly: Vaseline | Sigma | 16415 | |
Pipettes Research Plus | Eppendorf | Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example). | |
**10 µL | 933954 | ||
**2.5 µL | 933953 | These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended. | |
Polystyrene carboxylate beads | Polysciences | ||
**approx. 1 µm diameter | 08226 | ||
**approx. 4.5 µm diameter | 17140-5 | ||
Profilin 1 (human recombinant, untagged) | Cytoskeleton | PR02 | |
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) | Home-purified (Reference 14) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) | Cytoskeleton | VCG03 |