Bedömning av läkning av benfrakturer med hjälp av mikrodatortomografi

Summary

Mikrodatortomografi (μCT) är ett icke-destruktivt avbildningsverktyg som är avgörande för att bedöma benstrukturen i prekliniska studier, men det saknas konsensus om μCT-procedurer för att analysera benläkningsförhårdnader. Denna studie ger ett steg-för-steg μCT-protokoll som möjliggör övervakning av frakturläkning.

Abstract

Mikrodatortomografi (μCT) är den vanligaste avbildningsmodaliteten för att karakterisera den tredimensionella (3D) morfologin hos ben och nybildat ben under frakturläkning i translationella vetenskapliga undersökningar. Studier av läkning av långa benfrakturer hos gnagare involverar vanligtvis sekundär läkning och bildandet av en mineraliserad förhårdnad. Formen på den förhårdnad som bildas och tätheten hos det nybildade benet kan variera avsevärt mellan tidpunkter och behandlingar. Medan standardmetoder för att kvantifiera parametrar för intakt kortikalt och trabekulärt ben används i stor utsträckning och är inbäddade i kommersiellt tillgänglig programvara, finns det en brist på konsensus om procedurer för att analysera den läkande förhårdnaden. Syftet med detta arbete är att beskriva ett standardiserat protokoll som kvantifierar benvolymfraktion och förhårdnadsmineraltäthet i den läkande förhårdnaden. Protokollet beskriver olika parametrar som bör beaktas under avbildning och analys, inklusive provinriktning under avbildning, storleken på volymen av intresse och antalet skivor som kontureras för att definiera förhårdnaden.

Introduction

Mikrodatortomografi (μCT) har använts i stor utsträckning inom preklinisk benforskning, vilket ger icke-invasiva, högupplösta bilder för att utvärdera mikrostrukturen hos ben 1,2,3,4,5. μCT omfattar ett stort antal röntgenbilder, erhållna från ett roterande prov eller med hjälp av en roterande röntgenkälla och detektor. Algoritmer används för att rekonstruera volymetriska 3D-data i form av en stapel av bildsegment. Klinisk CT är guldstandarden för 3D-avbildning av mänskliga ben, och μCT är en vanlig teknik för att utvärdera benläkningseffektivitet hos försöksdjur 1,2,3,4,6,7. Mineraliserat ben har utmärkt kontrast till röntgen, medan mjukvävnader har relativt dålig kontrast om inte kontrastmedel används. Vid bedömning av frakturläkning genererar μCT bilder som ger detaljerad information om 3D-strukturen och densiteten hos den mineraliserade förhårdnaden. In vivo μCT-skanning kan också användas för longitudinell bedömning av frakturläkning över tid.

Kvantifieringen av intakt kortikalt och trabekulärt ben med hjälp av μCT är i allmänhet väletablerad och standardiserad⁸. Även om prekliniska studier använder en mängd olika kvantifieringsmetoder för att analysera frakturläkning 9,10,11^, har ett detaljerat protokoll för μCT-bildanalys för kalluskvantifiering ännu inte publicerats. Därför är syftet med denna studie att tillhandahålla ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för μCT-avbildning och analys av benläkningsförhårdnader.

Protocol

Följande protokoll utvecklades för att karakterisera förhårdnader med långa ben som skördats från avlivade möss. De flesta av stegen kan dock tillämpas på råttor och även användas för in vivo-skanning av brutna ben. Protokollet beskriver ett visst μCT-system och specifik programvara för bildbehandling, analys och visualisering (se materialförteckning), men metoden är allmänt tillämplig på andra skannrar och programvara. Protokollet godkändes av Institutional Animal Care and…

Representative Results

För att övervaka benbildningen under frakturläkning inducerades en öppen tibialfraktur i mitten av diafysen hos vuxna C75BL/6J-möss av hankön. Frakturen stabiliserades med hjälp av en intramedulär nagel, en etablerad modell för sekundär läkning13. Förhårdnadsvävnader skördades dag 14, 21 och 28 efter fraktur12. Dessa tidpunkter representerar olika faser av läkning. Endokondral benbildning under sekundär benläkning fortskrider via initial bildning …

Discussion

Syftet med denna studie är att beskriva ett detaljerat protokoll för μCT-analys med målet att noggrant kvantifiera den 3D-mineraliserade förhårdnadsstrukturen, vilket ofta är grundläggande i ben- och frakturläkningsstudier. Protokollet använder en toppmodern mjukvaruplattform för 3D-bildanalys som underlättar bildvisualisering, segmentering/märkning och mätningar som sträcker sig från enkla till komplexa.

Den mest tidskrävande uppgiften i protokollet är halvautomatisk segment…

Materials

10% neutral buffered formalin	Fisher chemical	SF100-20	Used for bone tissue fixation
Avizo	Thermo Scientific		Image processing and analysis software
Hydroxyapatite phantom	Micro-CT HA D4.5, QRM	QRM-70128
Image Processing Language	Scanco		Used to convert raw images to DICOM images
Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps	Medline		Used to remove the intramedullary pin
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
Scanco mCT system (vivaCT 40)	Scanco		Used for µCT imaging