Vurdering av benbruddheling ved hjelp av mikrocomputertomografi

Summary

Mikrocomputertomografi (μCT) er et ikke-destruktivt bildebehandlingsverktøy som er medvirkende til å vurdere beinstruktur i prekliniske studier, men det mangler konsensus om μCT-prosedyrer for å analysere benhelingskallus. Denne studien gir en trinnvis μCT-protokoll som gjør det mulig å overvåke bruddheling.

Abstract

Mikrocomputertomografi (μCT) er den vanligste bildemodaliteten for å karakterisere den tredimensjonale (3D) morfologien til bein og nydannet bein under bruddheling i translasjonsvitenskapelige undersøkelser. Studier av lang benbruddheling hos gnagere involverer vanligvis sekundær helbredelse og dannelse av en mineralisert callus. Formen på callus dannet og tettheten av det nydannede beinet kan variere vesentlig mellom tidspunkter og behandlinger. Mens standardmetoder for kvantifisering av parametere for intakt kortikal og trabekulært ben er mye brukt og innebygd i kommersielt tilgjengelig programvare, mangler det konsensus om prosedyrer for å analysere helbredelseskallus. Hensikten med dette arbeidet er å beskrive en standardisert protokoll som kvantifiserer beinvolumfraksjon og kallus mineraltetthet i helbredende callus. Protokollen beskriver forskjellige parametere som bør vurderes under avbildning og analyse, inkludert prøvejustering under avbildning, størrelsen på volumet av interesse og antall skiver som er konturert for å definere callus.

Introduction

Mikrocomputertomografi (μCT) avbildning har blitt mye brukt i preklinisk beinforskning, og gir ikke-invasive, høyoppløselige bilder for å evaluere mikrostrukturen av bein 1,2,3,4,5. μCT involverer et stort antall røntgenbilder, oppnådd fra en roterende prøve eller ved bruk av en roterende røntgenkilde og detektor. Algoritmer brukes til å rekonstruere 3D-volumetriske data i form av en stabel med bildeskiver. Klinisk CT er gullstandarden for 3D-avbildning av menneskelige bein, og μCT er en vanlig teknikk for å evaluere beinhelingseffektivitet hos forsøksdyr 1,2,3,4,6,7. Mineralisert bein har utmerket kontrast til røntgen, mens bløtvev har relativt dårlig kontrast med mindre et kontrastmiddel brukes. I vurderingen av bruddheling genererer μCT bilder som gir detaljert informasjon om 3D-strukturen og tettheten til den mineraliserte kallusen. In vivo μCT-skanning kan også brukes til langsgående, tidsløpsvurdering av bruddheling.

Kvantifiseringen av intakt kortikal og trabekulært ben ved bruk av μCT er generelt veletablert og standardisert⁸. Selv om prekliniske studier bruker en rekke kvantifiseringsmetoder for å analysere bruddheling 9,10,11^, er en detaljert protokoll for μCT-bildeanalyse for kalluskvantifisering ikke publisert ennå. Derfor er målet med denne studien å gi en detaljert trinnvis protokoll for μCT-avbildning og analyse av benheling callus.

Protocol

Følgende protokoll ble utviklet for å karakterisere langbeinsheling callus høstet fra euthaniserte mus. Imidlertid kan de fleste trinnene brukes på rotter og brukes også til in vivo-skanning av benbrudd. Protokollen beskriver et bestemt μCT-system og spesifikk bildebehandlings-, analyse- og visualiseringsprogramvare (se materialfortegnelse), men metodikken er generelt anvendelig for andre skannere og programvare. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved P…

Representative Results

For å overvåke bendannelse under bruddtilheling ble det indusert et åpent tibialbrudd midt i diafysen hos voksne, mannlige C75BL/6J-mus. Bruddet ble stabilisert ved hjelp av en intramedullær negl, en etablert modell for sekundær helbredelse13. Callusvev ble høstet på dagene 14, 21 og 28 etter brudd12. Disse tidspunktene representerer ulike faser av helbredelse. Endokondral beindannelse under sekundær beinheling fortsetter via innledende dannelse av en fibro…

Discussion

Formålet med denne studien er å beskrive en detaljert protokoll for μCT-analyse med mål om nøyaktig kvantifisering av 3D-mineralisert kallusstruktur, som ofte er grunnleggende i bein- og bruddhelingsstudier. Protokollen benytter en generell state-of-the-art 3D-bildeanalyseprogramvareplattform som letter bildevisualisering, segmentering / merking og målinger som spenner fra enkle til komplekse.

Den mest tidkrevende oppgaven i protokollen er semi-automatisert segmentering av callus, med ut…

Materials

10% neutral buffered formalin	Fisher chemical	SF100-20	Used for bone tissue fixation
Avizo	Thermo Scientific		Image processing and analysis software
Hydroxyapatite phantom	Micro-CT HA D4.5, QRM	QRM-70128
Image Processing Language	Scanco		Used to convert raw images to DICOM images
Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps	Medline		Used to remove the intramedullary pin
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
Scanco mCT system (vivaCT 40)	Scanco		Used for µCT imaging