Purificazione dei polisomi dai noduli simbiotici di soia

María  Martha Sainz; Carla Valeria Filippi; Guillermo Eastman; Mariana Sotelo-Silveira; C. Mauro Martinez; Omar Borsani; José Sotelo-Silveira

doi:10.3791/64269

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Articolo metodologico

Purificazione dei polisomi dai noduli simbiotici di soia

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DOI:

10.3791/64269

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1 luglio 2022

María Martha Sainz¹ , Carla Valeria Filippi¹ , Guillermo Eastman²^,³ , Mariana Sotelo-Silveira¹ , C. Mauro Martinez¹ , Omar Borsani¹ , José Sotelo-Silveira²^,⁴

¹Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, ²Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, ³Department of Biology, University of Virginia, ⁴Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per la purificazione dei polisomi eucariotici da noduli di soia intatti. Dopo il sequenziamento, le pipeline standard per l'analisi dell'espressione genica possono essere utilizzate per identificare geni differenzialmente espressi a livello di trascrittoma e translatoma.

Abstract

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una strategia per lo studio del translatoma eucariotico del nodulo simbiotico di soia (Glycine max). Questo articolo descrive metodi ottimizzati per isolare i poliribosomi di origine vegetale e i loro mRNA associati da analizzare utilizzando il sequenziamento dell'RNA. In primo luogo, i lisati citoplasmatici sono ottenuti attraverso l'omogeneizzazione in condizioni di conservazione di polisomi e RNA da noduli di soia interi e congelati. Quindi, i lisati vengono eliminati mediante centrifugazione a bassa velocità e il 15% del surnatante viene utilizzato per l'isolamento totale dell'RNA (TOTAL). Il restante lisato eliminato viene utilizzato per isolare i polisomi mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio a due strati (12% e 33,5%). L'mRNA associato ai polisomi (PAR) viene purificato dai pellet polisomiali dopo la risospensione. Sia TOTAL che PAR sono valutati mediante elettroforesi capillare altamente sensibile per soddisfare gli standard di qualità delle librerie di sequenziamento per RNA-seq. Come esempio di applicazione a valle, dopo il sequenziamento, è possibile utilizzare pipeline standard per l'analisi dell'espressione genica per ottenere geni differenzialmente espressi a livello di trascrittoma e translatoma. In sintesi, questo metodo, in combinazione con RNA-seq, permette lo studio della regolazione traslazionale degli mRNA eucariotici in un tessuto complesso come il nodulo simbiotico.

Introduzione

Le leguminose, come la soia (Glycine max), possono stabilire simbiosi con specifici batteri del suolo chiamati rizobia. Questa relazione mutualistica provoca la formazione di nuovi organi, i noduli simbiotici, sulle radici delle piante. I noduli sono gli organi vegetali che ospitano i batteri e sono costituiti da cellule ospiti il cui citoplasma è colonizzato con una forma specializzata di rizobia chiamata batterioidi. Questi batterioidi catalizzano la riduzione dell'azoto atmosferico (N 2) in ammoniaca, che viene trasferita alla pianta in cambio di carboidrati ^1,2.