Presentert her er en protokoll for generering av formalinfaste, parafin-innebygde cellepelletskontroller for immunhistokjemi.
Positive og negative kontroller med kjent ekspresjon av målproteiner er avgjørende for utviklingen av immunhistokjemi (IHC) analyser. Mens vevskontroller er gunstige for godt karakteriserte proteiner med definerte vevs- og cellulære uttrykksmønstre, er de mindre egnet for den første utviklingen av IHC-analyser for nye, dårlig karakteriserte eller allestedsnærværende uttrykte proteiner. Alternativt, på grunn av deres standardiserte natur, kan cellepellets, inkludert kreftcellelinjer med definerte protein- eller transkripsjonsuttrykksnivåer (f.eks. Høy, middels og lavt uttrykk), transfiserte overuttrykkende cellelinjer eller cellelinjer med gener slettet gjennom celleteknikkteknologier som CRISPR, tjene som verdifulle kontroller, spesielt for den første antistoffkarakteriseringen og utvelgelsen. For at disse cellepelletsene skal kunne brukes i utviklingen av IHC-analyser for formalinfaste, parafin-innebygde vev, må de behandles og bygges på en måte som rekapitulerer prosedyrene som brukes til vevsbehandling. Denne protokollen beskriver en prosess for å lage og behandle formalinfaste, parafininnebygde cellepelletskontroller som kan brukes til utvikling av IHC-metoder.
Immunhistokjemi (IHC) er en av de mest brukte analysene innen undersøkende og diagnostisk patologi. Avhengig av kontekst og analyse brukes IHC til å bistå i kreftdiagnose1,2, forutsi behandlingsrespons3,4, identifisere patogener5, karakterisere celletyper i syke vev6 og studere biologiske veier og vevsresponser 7,8. I alle situasjoner er det grunnleggende prinsippet for en IHC-analyse at et antistoff binder seg spesifikt til et mål av interesse, oftest et protein, og denne bindingshendelsen blir deretter visualisert i et vevsavsnitt9. En av de største utfordringene ved enhver IHC-analyse er imidlertid å sikre at antistoffene spesifikt oppdager målet for interesse10. Antistoffspesifisitet er en utfordring i de fleste immunanalyser, men immunhistokjemi gir unike utfordringer ved at det ikke finnes sekundære mål, for eksempel molekylvekt, for å skille mellom spesifikk og ikke-spesifikk merking. Dette er spesielt plagsomt når man vurderer dårlig karakteriserte eller allestedsnærværende uttrykte mål som mangler veldefinerte cellulære lokaliseringsmønstre. Derfor er robuste kontroller som kan bidra til å karakterisere bindingsspesifisitet avgjørende når man utvikler en ny IHC-analyse10.
For mål som er veldefinerte med karakteristiske cellulære uttrykksmønstre, brukes vevskontroller ofte i IHC-metodeutvikling. Basert på et vell av tidligere data, kan man avgjøre om antistoffet merker vevet, cellen og det subcellulære rommet der det er kjent å bli uttrykt, og at det ikke merker vevskomponenter der det ikke skal være til stede11. Imidlertid er vevskontroller av begrenset bruk for dårlig karakteriserte, nye mål uten kjente uttrykksmønstre eller for proteiner som er bredt uttrykt og mangler distinkte uttrykksmønstre. I begge disse scenariene gjør mangelen på et veldefinert uttrykksmønster det umulig å diskriminere spesifikk fra ikke-spesifikk merking i vev. I disse situasjonene tilbyr cellepellets en verdifull alternativ IHC-kontroll. Cellepelletskontroller kan omfatte: kreft eller andre cellelinjer som har endogene eller inneboende / ikke-induserte ekspresjonsnivåer av proteinet av interesse, og hvis proteinuttrykk kan karakteriseres ved vestlig blotting, flowcytometriske analyser eller ekstrapolert fra transkripsjonell profilering; konstruerte cellelinjer som enten over-uttrykker proteinet av interesse eller har kodingsgenet av interesse slettet; eller celler som har blitt behandlet under spesifikke forhold for å indusere proteinuttrykk eller signalhendelser av interesse (f.eks. fosforylering)10,12. Godt karakteriserte proteinuttrykksnivåer i cellelinjer tillater også evaluering av følsomheten til en analyse ved å bruke et panel av cellelinjer med høyt, middels, lavt og fraværende proteinuttrykk. I tillegg kan konstruerte cellepellets være verdifulle artsspesifikke kontroller for veterinære arter, som det kan være begrenset karakterisering eller tilgjengelige vevskontroller13. Mens cellepellets har sine begrensninger, for eksempel det begrensede proteomet som er tilstede i cellelinjer som ikke vil gjenspeile det forskjellige proteomet i vev, tjener de som egnede kontroller for å bekrefte at antistoffet kan oppdage målet av interesse, samt utelukke vilkårlig binding av det primære antistoffet, sekundært antistoff eller andre regenter i analysen10.
De fleste vev i diagnostisk og undersøkende patologi er festet i nøytral bufret formalin, dehydrert i en serie alkoholer, ryddet i xylen og behandlet og innebygd i parafinvoks. Formalinfiksering kryssbindingsproteiner, og fiksering og hvert ekstra trinn i vevsbehandling kan direkte påvirke proteiner og antistoffenes evne til å oppdage dem 9,14. Derfor er det viktig at alle kontroller som brukes i en IHC-analyse, gjennomgår de samme fikserings-, vevsbehandlings- og innebyggingsprosedyrene. Denne artikkelen beskriver de unike hensynene til å behandle og legge inn dyrkede celler for å tjene som kontroller for å utvikle IHC-analyser i formalinfikserte parafininnstøpte vev, med metodikken primært fokusert på håndtering og behandling av cellepelleten i et histologisk laboratorium.
Denne protokollen beskriver en metode for å generere formalin-faste, parafin-innebygde cellepellets som kan brukes som kontroller for nedstrøms immunhistokjemi og in situ hybridiseringsstudier. Histologimetodene beskrevet i denne protokollen gjelder for et mangfoldig utvalg av kreft- og primære cellelinjer, og tilpasser primært rutinemessige histologiteknikker for å produsere disse pellets17,18. Når de behandles og legges inn, kan pellets brukes på samme måte som vev. Dette inkluderer bruk av dem med varmeinduserte og enzymatiske antigeninnhentingsprotokoller for immunhistokjemieksperimenter. Et mål med metodene som brukes i denne protokollen er å bevare morfologien og antigeniteten til cellene gjennom hele prosessen. Derfor brukes EDTA, som er relativt forsiktig når det gjelder endringer i både morfologi og antigenitet, for å løsne cellene. Dette er ikke å si at andre tilnærminger, som fysisk forstyrrelse, ikke er levedyktige; Imidlertid bør enhver tilnærming til å løsne celler sikre at cellene ikke blir skadet i prosessen. Det andre målet med denne protokollen er å fikse og behandle cellene på en måte som ligner på vev, ved hjelp av samme fikseringsmiddel, fikseringsforhold, behandlingsplan (fiksering, dehydrering, rydding og parafininfiltrasjon) og innebyggingsteknikker, slik at de kan tjene som sammenlignbare kontroller for nedstrøms analyser. Derfor bør fikserings- og behandlingsmetodene som brukes til å generere cellepellets, etterligne tilnærmingene som brukes til vev.
Protokollen beskrevet i denne rapporten er ikke tilpasset for å håndtere celler med smittestoffer, for eksempel celler infisert med sykdomsfremkallende bakterier eller virus, da celler løsnes, samles inn og sentrifugeres før fiksering. Forskere kan vurdere protokoller for å fikse cellene før løsrivelse, men dette vil kreve ytterligere optimalisering for å samle cellene uten å forstyrre cellemorfologien. Videre krever fikseringstider og håndteringsbetingelser for celler med smittsomme stoffer ytterligere hensyn basert på smittestoffet og tilhørende institusjonelle biosikkerhetsprotokoller.
Formalin-faste, parafin-innebygde cellepellets er unikt fordelaktige ved å ha veldefinerte proteinuttrykksnivåer10. Mens kreft og endogene cellelinjer tilbyr et utvalg av celler med varierende nivåer av proteinuttrykk, gjør genteknologiske teknologier det mulig for forskere å modellere proteinuttrykket, gjennom overuttrykkende proteiner av interesse og bruk av CRISPR-teknologier for å excise eller sette inn kodende gener av interesse20,21 . Ulempen med over-uttrykte proteiner i cellelinjer er at de er dårlige tiltak for følsomheten til en analyse, da de kanskje ikke representerer endogene proteinnivåer22. I motsetning til dette kan både endogene cellelinjer og kreftcellelinjer bedre representere endogene ekspresjonsnivåer, og CRISPR-mediert sletting av kodegenet i en beslektet linje kan tjene som en tilsvarende negativ kontroll. Videre er endogene cellelinjer eller kreftcellelinjer med varierende nivåer av proteinuttrykk ideelle for titreringseksperimenter for å velge endelige antistofffortynninger og for best å forstå sensitiviteten til en analyse (figur 2). Beslutningen rundt hvilke cellelinjer som skal brukes, bør være basert på individuelle eksperimentelle behov og vil ofte benytte en kombinasjon av tilnærminger.
I tillegg til å vurdere om et antistoff kan oppdage proteinet av interesse, kan et panel av cellelinjer brukes til å definere et antistoffs spesifisitet. For eksempel kan et panel av cellelinjer som individuelt uttrykker en familie av nært beslektede proteiner, brukes til å teste om et antistoff er spesifikt for et individuelt protein, eller om det også oppdager andre nært beslektede proteiner. Mer forseggjorte kontroller kan innebære bruk av cellelinjer som uttrykker, enten gjennom CRISPR-knock-in eller gjennom overuttrykk, proteiner med punktmutasjoner som ikke kan gjennomgå spesifikke signalhendelser som oppdages (f.eks. mutasjon i spesifikke fosforyleringssteder ved evaluering av et fosfospesifikt antistoff). Selv om disse er mer komplekse tilnærminger, kan de være nødvendige for å bekrefte at antistoffet bare brukte etiketter under spesifikke omstendigheter10.
Det er viktig å merke seg at genetiske manipulasjoner av cellelinjer kanskje ikke genererer en homogen cellepopulasjon. For eksempel er transfeksjonseffektiviteten i overuttrykkende cellelinjer vanligvis ikke 100%, og noen celler kan ikke overuttrykke proteinet av interesse. Inkludering av FLAG eller en relatert tag i transfeksjonen som kan oppdages med standardmetoder, kan være nyttig for å vurdere transfeksjonseffektiviteten til cellelinjen23. Dette kan være nyttig både for å avgjøre om transfeksjon var vellykket og utelukke mangel på deteksjon på grunn av proteinuttrykket, og for å tjene som referanse for den forventede andelen celler som skal uttrykke proteinet av interesse.
In situ hybridisering (ISH) kan også være et gunstig verktøy for å karakterisere målgenuttrykket i cellepellets og informere IHC-metodeutvikling10. Ved screening av antistoffer kan det være informativt å vite når transkriptet, og dermed det potensielle proteinet, kan detekteres. I tillegg kan cellepellets ISH-screening være gunstig for utvikling av ISH-metoder. Selv om spesifisitet sjeldnere er et problem for ISH-analyser, er det fortsatt viktig å ha passende kontroller og lignende hensyn til utvikling og bruk av kontroller som kan brukes på ISH-studier.
Vevsmikromatriser opprettes ved å fjerne kjerner fra donorblokker og overføre disse kjernene, ofte i et rutenettmønster, til en mottakerparaffinblokk. Til slutt inneholder mottakerblokken et spekter av prøver i en enkelt blokk, slik at alle prøvene i blokken kan gå gjennom identiske IHC-prosedyrer og muliggjør direkte sammenligning av flere prøver på samme lysbilde24,25. Siden cellepellets er relativt ensartede populasjoner, kan de nøyaktig representeres av 1 mm kjerner, noe som gjør dem ideelle kandidater for inkludering i lignende arrays. Ved hjelp av en cellepelletsmatrise er det mulig å inkludere cellepellets med varierende ekspresjonsnivåer, cellepellets som unikt uttrykker relaterte proteiner, og cellepellets som uttrykker ortologer av proteinet av interesse fra forskjellige arter i et enkelt lysbilde (figur 3). Dette gjør at alle cellepellets kan evalueres samtidig under ensartede forhold på en rask måte, samtidig som bruken av reagenser minimeres25.
Et minimum startcellepelletsvolum på 2 ml samlet fra åtte T175-kolber anbefales for denne protokollen. Dette volumet tillater produksjon og arkivering av flere cellepelletsblokker, slik at cellepelletskontroller kan standardiseres over lengre tidsperioder og flere cellepelletsarrayer kan opprettes fra en gitt pellet. Lavere cellepelletsvolumer kan brukes når det gjelder primære pasientavledede cellelinjer, sakte voksende cellelinjer, eller når forholdene begrenser volumet av prøven. Selvfølgelig vil lavere startvolumer forsterke den negative effekten fra ethvert celletap under fiksering og fremstilling av pelleten og vil begrense materialet som er tilgjengelig for nedstrømsprosesser. Det er spesielt viktig å være forsiktig når du fjerner fikseringsmiddel etter sentrifugering, for å minimere eventuelle tilknyttede tap. For lavere prøvevolumer kan et 1,5 ml, avkortet sentrifugerør brukes til å pelletere cellene. Disse rørene kan halvveis i lengderetningen med et blad for behandling.
I likhet med vevsfiksering er cellefiksering i denne pelleten kritisk for nedstrøms IHC-vurderinger. For å oppnå fullstendig fiksering bruker vi minst et 10: 1 formalin til cellepelletforhold og inverterer det koniske røret for å opprettholde cellene i suspensjon. Hvis cellene ikke er i suspensjon på tidspunktet for fiksering, er det fare for ufullstendig eller utilstrekkelig fiksering, noe som vil påvirke nedstrøms immunmerking. Ofte manifesterer dette seg som sterk merking i periferien og tap av merking i midten av pelleten eller merking av variabel intensitet i hele pelleten.
Denne protokollen bruker Histogel, som hovedsakelig består av hydroksyetylagarose, både for å binde cellepelleten og for å gjøre det mulig for cellene å bli jevnt fordelt over hele cellepelleten. Uten det blir cellene komprimert og mister sine cytomorfologiske detaljer. Disse cytomorfologiske detaljene er ofte viktige under antistoffscreening, da de gir ytterligere informasjon om hvorvidt antistoffet merker i riktig subcellulært rom (f.eks. Kjernen, cytoplasma eller plasmamembranen). I motsetning til dette kan for mye gel resultere i lavere celletettheter i pelleten, noe som fører til at cellene blir bredt distribuert, og reduserer celletallene per seksjon.
Denne protokollen kan rutinemessig brukes til å utvikle IHC-kontroller. Materialene som trengs for å lage disse pellets er vanlige i undersøkelsesbiologi og histologilaboratorier, og metodene er enkle og enkle å tilpasse. Mens cellepellets har begrensninger som IHC-kontroller, fungerer de som gode verktøy for innledende antistoffscreening og utfyller andre vevskontroller.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne samarbeidet med våre kolleger i Genentechs forskningsorganisasjon, og spesielt patologikjernen (P-kjerne) laboratorier som bidro til utviklingen av disse metodene gjennom årene.
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
Flex 100 | Epredia | 8101 | |
Flex 95 | Epredia | 8201 | |
Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
Xylenes | VWR | 89370-088 |