从P3HR1细胞系分离和定量EB病毒

Summary

该协议允许在用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导病毒裂解循环时从人P3HR1细胞系中分离Epstein-Barr病毒颗粒。随后从病毒制剂中提取DNA，并进行实时PCR以量化病毒颗粒浓度。

Abstract

爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV），正式名称为 人类疱疹病毒4 （HHV-4），是第一个分离的人类肿瘤病毒。世界上近90-95%的成年人口感染了EB病毒。随着分子生物学和免疫学的最新进展， 体外 和 体内 实验模型的应用为EBV在许多疾病的发病机制以及EBV相关的肿瘤发生提供了深刻而有意义的见解。这篇可视化实验论文的目的是概述从P3HR1细胞系细胞中分离EBV病毒颗粒，然后对病毒制剂进行定量。P3HR1细胞最初是从人伯基特淋巴瘤中分离出来的，可以产生P3HR1病毒，这是一种2型EBV毒株。通过用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）处理，可以在这些P3HR1细胞中诱导EBV裂解循环，产生EBV病毒颗粒。

使用该协议分离EBV颗粒，将P3HR1细胞在含有35ng / mL PMA的完整RPMI-1640培养基中在37°C和5%CO₂ 下培养5天。随后，将培养基以120× g 的速度离心8分钟以沉淀细胞。然后收集含病毒的上清液并以16，000× g 的速度旋转90分钟以沉淀EBV颗粒。然后将病毒沉淀重悬于完整的RPMI-1640培养基中。随后进行DNA提取和定量实时PCR，以评估制剂中EBV颗粒的浓度。

Introduction

EB病毒（EBV）是第一个被分离出来的人类肿瘤病毒¹。EB病毒，正式名称为 人类疱疹病毒4 （HHV-4）²，是疱疹病毒家族的γ疱疹病毒亚科的一部分，是 淋巴密码病毒 属的原型。世界上近90-95%的成年人口感染了该病毒³。在大多数情况下，初始感染发生在生命的前 3 年内并且是无症状的，但是，如果感染发生在青春期后期，则可能会引起称为传染性单核细胞增多症的疾病⁴。EBV能够感染静息的B细胞，诱导它们成为增殖的B淋巴母细胞，其中病毒建立并维持潜伏感染状态⁵。EB病毒可以随时重新激活，从而导致复发性感染⁶。

在过去的50年中，某些病毒与人类恶性肿瘤发展之间的关联变得越来越明显，今天估计所有人类癌症中有15%至20%与病毒感染有关⁷。疱疹病毒，包括EB病毒，是这些类型^{肿瘤病毒中}研究得最好的例子8。事实上，EBV可引起多种类型的人类恶性肿瘤，如伯基特淋巴瘤（BL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤和免疫功能低^{下的宿主的}淋巴组织增生性疾病9^，10。EB病毒也被证明与系统性自身免疫性疾病的发展有关。这些自身免疫性疾病的一些例子是类风湿性关节炎 （RA）、多发性肌炎-皮肌炎 （PM-DM）、系统性红斑狼疮 （SLE）、混合性结缔组织病 （MCTD） 和干燥综合征 （SS）¹¹。EB病毒也与炎症性肠病（IBD）的发展有关¹²。

许多这些疾病可以使用细胞培养物，小鼠或其他感染EBV的生物体进行研究或建模。这就是为什么需要EBV颗粒来感染细胞或生物体，无论是体外还是体内模型¹³，^14，15，^16，因此需要开发一种能够以低成本分离病毒颗粒的技术。此处描述的方案提供了一种简单的方法，可以从相对容易获得的细胞系中可靠地分离EBV颗粒，并使用实时荧光定量PCR对颗粒进行定量，这是经济高效的，并且大多数实验室都可以轻松获得。这是与已经描述的从不同细胞系中分离EBV的其他几种方法相比¹⁷，^18，19，20。

P3HR-1是一种在悬浮液中生长并潜伏感染EBV 2型菌株的BL细胞系。该细胞系是EBV生产者，可以诱导产生病毒颗粒。本手稿的目的是展示一种允许从P3HR-1细胞系中分离EBV颗粒的方法，然后对病毒储液进行定量，以后可用于 体外 和 体内 EBV实验模型。

Protocol

注意：EB病毒应被视为潜在的生物危害性材料，因此应在生物安全2级或更高遏制下处理。应穿实验室外套和手套。如果有可能接触到飞溅物，还应考虑保护眼睛。以下程序应在生物安全柜中进行。 1. 计数 P3HR1 细胞 离心和重悬细胞将细胞悬液从正在进行的P3HR1细胞培养物的100 mm培养板（或T-25烧瓶）中以80%汇合度转移到15 mL锥形管中。P3HR-1 细胞的接种?…

Representative Results

该程序的目标是在具有已知病毒滴度的悬浮液中分离EBV颗粒，随后可用于模拟EBV感染。因此，使用不同试剂的最佳浓度以获得最高的EBV产量至关重要。 进行优化试验以确定产生最多EBV颗粒的PMA和DMSO浓度（图2）。DMSO浓度为0.8%，PMA浓度为35 ng/μL是最佳的，并导致高EBV浓度。从优化方案获得的病毒颗粒浓度为917，471个病毒颗粒/μL。 <p class="jove_content bigle…

Discussion

EBV颗粒的产生对于了解该病毒的生物学及其相关疾病是必要的。在这里，我们描述了从P3HR-1细胞系中产生这些颗粒的过程。该细胞系不是唯一的EBV生产者系;事实上，EBV颗粒也已从B95-8细胞²¹，²²以及Raji细胞系^18，19中分离出来。EBV裂解循环已在这些细胞中用正丁酸盐诱导。或者，可以使用佛波醇酯，例如12-O-十?…

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	AB0620	Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips	Corning	4807	Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette	BrandTech	704770
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4488
1000 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
100×20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL Pipette	BrandTech	704774
15 mL Conical Tubes	Corning	430791
200 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055
50 mL Conical Tubes	Corning	430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
DNase/RNase Free Water	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)	Vircell	MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
Hemocytometer	BOECO	BOE 01
Inverted Light Microscope	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Microcentrifuge Tube	Costar (Corning)	3621	Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line	ATCC	HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Pipette Filler	Thermo Scientific	9501
Precision Wipes	Kimtech	7552
RPMI-1640 Culture Medium	Sigma	R7388
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Sodium Acetate	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
Spectrophotomer	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4121